Димерный дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6, активирующий PI3K/AKT и МЕК/MAPK/ERK, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу
Вт, 27 Фев 2018
506

Резюме. Димерный дипептидный миметик 1-й петли NGF ГК-6 (10–6М), активирующий как фосфатидилинозитол-3/Akt-киназный, так и митоген-активируемый протеинкиназный (MEK/MAPK/ERK) сигнальные каскады, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу. В то же время димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF ГК-2 (10–6М), активирующий только фосфатидилинозитол-3/Akt- киназный путь, не обладает дифференцирующим действием.

Ключевые слова: NGF, димерные дипептидные миметики, ГК-2, ГК-6, дифференцировка, РС12, бета-тубулин 3

Dimeric dipeptide mimetic the 1st loop of nerve growth factor of GK-6, which activates PI3K/AKT and MEK/MAPK/ERK, causes a neuronal type differentiation of PC12 cells

Antipova T.A.1 , Nikolaev S.V.1 , Revishchin A.V.2 , Savchenko E.A.2 , Pavlova G.V.2 , Gudasheva T.A.1

1 – FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

2 – Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow

Resume. Dimeric dipeptide mimetic 1st loop of NGF GK-6 (10–6M) activating as phosphatidylinozitol 3-kinase/Akt and mitogenactivated protein kinase MEK/MAPK/ERK) signaling cascades causes PC12 cell differentiation into neuron-like cells. At the same time dimeric dipeptide mimetic the 4th loop of NGF GK-2 (10–6M), which activates only phosphatidylinozitol 3-kinase/Akt, does not possess the differentiating effect.

Keywords: NGF, dimeric dipeptide mimetics of NGF, differenciation, PC12, beta-tubulin III

Автор, ответственный за переписку: Антипова Татьяна Алексеевна – заведующая лабораторией фармакологии нейропротекции, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; тел. +7 (495) 601-22-43; e-mail: zenina_tatyana@mail.ru

Введение

Развивающиеся нейроны для своего выживания и дифференцировки нуждаются в нейротрофинах, наиболее изученным из которых является фактор роста нервов (NGF). Известно, что эффекты этого нейротрофина на выживаемость и рост отростков нейронов обусловлены взаимодействием с TrkА рецептором. Связывание с NGF ведёт к димеризации и активации TrkA путём аутофосфорилирования внутриклеточных тирозиновых остатков [13]. Это инициирует запуск сигнального трансдукционного каскада, включающего фосфатидилинозитол-3 киназный (PI3K/AKT) и митоген-активируемый протеинкиназный (МЕК/ MAPK/ERK) пути. Активация PI3K/AKT способствует выживанию нейронов. MEK/MAPK/Erk-киназный путь контролирует в основном деление и дифферен- цировку клеток [10, 12].

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова была сформулирована гипотеза, что разные функции NGF контролируются взаимодействием разных петель с одним и тем же TrkА-рецептором [7]. В рамках этой гипотезы были получены ГК-2 (гексаметилендиа- мид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)), димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF, и ГК-6 (гексаметилендиамид бис-(N-аминокапроил- глицил-L-лизина)), миметик 1-й петли NGF. Оба миметика активировали TrkA-рецептор, PI3K/AKT, и обладали нейропротекторным эффектом [2]. ГК-6, кроме того, активировал ещё и MEK/MAPK/Erkкиназный путь [1].

Цель исследования

Целью настоящего исследования было показать, что миметик 1-й петли ГК-6, но не миметик 4-й петли NGF ГК-2, обладает дифференцирующей активностью.

Материалы и методы

Все манипуляции с клетками выполнялись в строго стерильных условиях. Клетки культивировали при температуре 37 °С, 5 % СО2 в среде ДМЕМ (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, HyClone, США), содержащей 5 % FBS (фетальной бычьей сыворотки, Gibco, США) для клеток линий НТ-22 и РС12 и 10 % FBS для нейробластомы человека линии SH-SY5Y, 2мМ L-глутамина (ICN Pharmaceuticals, США). Смену культуральной среды производили через 24 ч после рассева и каждые последующие 3 дня. Рассев на культуральные флаконы общей площадью 75 см2 (Corning-Costar, США) осуществляли каждую неделю.

Недифференцированые клетки РС12 рассеивали с плотностью 3,5 тыс на лунку в среде ДМЕМ с 1 % сывороткой FBS. В момент посева в среду культивирования добавляли NGF в качестве положительного контроля в конечной концентрации 100 нг/мл (BD Bioscience, Великобритания), пептиды ГК-2 и ГК-6 в конечных концентрациях 10–5–10–8М. Концентрация NGF (≈10–9 М) используется в экспериментах по вы- явлению нейропротекторной и дифференцирующей активности на клетках РС12 [6] и не является токсичной для клеток [16].

В дальнейшем исследуемые пептиды и NGF вносили в среду каждые 48 ч в течение 6 сут. О степени дифференцировки клеток судили по форме и размерам клеток, количеству и длине отростков. Дифференцированными считались клетки, имевшие отростки размером более, чем величина диаметра тела клетки.

Для окраски клеток РС12 на нейрональный маркер бета-тубулин 3 (Abcam, Великобритания) пептиды вносили по той же схеме. После этого клеточную среду отбирали, клетки промывали 2 раза холодным PBS и фиксировали 4 % формальдегидом в PBS. Окрашивание клеток антителами на бета-тубулин 3 в разведении 1:100 проводили в течение ночи при 4 °С в PBS, содержащем 1 % BSA и 0,1 % Tween. В качестве вторичных использовали антитела козы против иммуноглобулина кролика конъюгированные флуоресцентным красителем DyLight 488 (Abcam, США) в разведении 1:250 в течение 1 ч. Фотографирование клеток проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TS100-F (Япония) при увеличении µ100.

Результаты и обсуждение

Для определения дифференцирующей активности пептидных миметиков фактора роста нервов использовали клетки феохромоцитомы крысы линии РС12. Известно, что эти клетки содержат TrkА рецепторы и при добавлении NGF дифференцируются по нерональному типу [5].

Дипептидный миметик ГК-2 в отличие от NGF не вызывал дифференцировку клеток линии РС12 ни в одной из исследуемых концентраций от 10–5 до 10–8 М. Внешний вид клеток РС12 после обработки ГК-2 не отличался от контроля, образование отростков не наблюдалось (рис. 1).

В то же время на 6-й день после внесения в среду культивирования ГК-6 в конечной концентрации 10–6 М недифференцированные клетки РС12 образовывали цитоплазматические отростки, величина которых превышала диаметр клетки (см. рис. 1). Для подтверждения дифференцировки клеток РС12 по нейрональному типу было использовано окрашивание на нейрональный маркер бета-тубулин III, поскольку последний экспрессируется в дендритах, аксонах и окончаниях аксонов нейронов исключительно при дифференцировке клеток по нейрональному типу [4, 11].

Как видно на рис. 2, в терминалях дифференцированных клеток РС12 как под действием ГК-6 (10–6 М), так и NGF (≈10–9 М) действительно обнаруживается бета-тубулин III.

Таким образом, дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6 вызывает дифференцировку клеток РС-12 по нейрональному типу. Полученные нами данные об отсутствии дифференцирующего действия у ГК-2, который активирует Akt-путь и не активирует Erk и наличия дифференцирующей активности у ГК-6, который активирует оба сигнальных пути, согласуются с данными литературы [3, 8] о необходимости активации MEK/MAPK/Erkкиназного пути для дифференцировки клеток по нейрональному типу.

Таким образом, выявленная нами способность у исследованных пептидов вызывать дифференцировку (ГК-6) либо отсутствие таковой (ГК-2) свидетельствует в пользу того, что разные петли NGF могут быть ответственны за разные функции этого белка.

При изучении активации TrkA рецептора после внесения ГК-2 и ГК-6 нами были использованы антитела на TrkA, содержащий фосфорилированный тирозин Y490. Было показано, что оба этих дипептида вызывали фосфорилирование TrkA рецептора по этому тирозину. При этом ГК-2 и ГК-6 имели разный паттерн активации пострецепторных сигнальных киназ. Можно предположить, что фосфорилирование других тирозиновых последовательностей вовлечено в активацию разных пострецепторных сигнальных путей под действием димерных миметиков разных петель фактора роста нервов и, в конечном итоге, в дивергенцию функций NGF. Согласно данным литературы, существует несколько тирозиновых остатков, фосфорилирование которых приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей. Три из них, Y670, Y674 и Y675, представлены в активирующей петле киназного домена и регулируют киназную активность рецептора. Фосфорилирование этих остатков необходимо для конформационных изменений, обеспечивающих взаимодействие каталитического центра и С-концевых последовательностей тирозина. Фосфорилирование Y785 связано с активацией фосфолипазы PLС-γ, ответственной за процесс клеточной дифференцировки и активацию Erk1/2 [8]. Мутация хотя бы одного из трёх остатков Y670, Y674 и Y675 активирующей петли полностью предотвращают фосфорилирование Y785 и последующую активацию Erk1/2 и PLС-γ. Фосфорилирование Y499 приводит к активации адапторного белка Shc, фосфорилирование Y760 – к активации PI3 киназы, Y794 – к активации PLС-γµ [15]. Отдельные мутации этих трёх остатков тирозина ингибируют рост нейритов в культуре клеток РС12 [9].

Кроме того, существует также независимый от фосфорилирования остатка 490 путь, приводящий к дифференцировке и повышению выживаемости клеток через другие адаптеры. Например, имеются два дополнительных адаптера, rAPS и SH2-B, фосфорилирующиеся при активации Trk-рецептора. Они могут образовывать гомо- и гетеродимеры и образовывать комплекс с адаптерным белком Grb2, обеспечивающий проведение сигнала через белок SOS к Ras/МАРК/ERk и через комплекс белков Ras/Gab к фосфоинозитол- 3-киназе. Показано, что использование антител к SH2-B препятствует NGF-зависимой выживаемости, активации Erk и аксональному росту симпатических нейронов [14].

Arevalo J. et al. указывают на наличие ещё одного сигнального комплекса, ответственного за селективную активацию Erk-киназ [3]. Этот комплекс образуется после взаимодействия трансмембранных доменов TrkА и ARMS. Тирозин Y1096 ARMS фосфорилируется после связывания нейротрофинов с рецепторами и обеспечивает образование докинг сайтов для CrkL, приводящее к Rap1-зависимой долговременной активации Erk-киназ. Нарушения взаимодействия Trk с ARMS или ARMS с CrkL (белком, содержащим домен SH2 и два домена SH3 (src-гомологичные домены)) с помощью мутаций тирозина Y1096 ARMS существенно снижает пролонгированный нейротрофиновый сигналинг Erk, но не влияет на Ras или Akt активацию [3].

Таким образом, конечный ответ клетки на разные сигналы бывает различным, в зависимости от первого участника проведения сигнала от TrkA-рецептора. Активация под действием ГК-2 или ГК-6 одного или двух сигнальных каскадов, а также наличие или отсутствие дифференцирующего действия может быть связано, в частности, с фосфорилированием тирози- новых остатков, отличных от Y490 и далее различных вариантов образующихся комплексов адаптерных белков, участвующих в трансдукции сигнала, что требует дальнейшего изучения.

Литература

1. Антипова Т.А., Логвинов И.О., Николаев С.В., Круглов С.В., Тарасюк А.В., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Сравнительный анализ активации пострецепторных сигнальных путей димерными дипептидными миметиками разных петель NGF. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016; 2: 14–17.

2. Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов. ДАН. 2010; 434:4: 549–552.

3. ArÛvalo J.C., Pereira D.B., Yano H., Teng K.K., Chao M.V. Identification of a switch in neurotrophin signaling by selective tyrosine phosphorylation. J Biol Chem. 2006; 281:2:1001-1007.

4. CÛceres A., Banker G.A., Binder L. Immunocytochemical localization of tubulin and microtubule-associated protein 2 during the development of hippocampal neurons in culture. J Neurosci. 1986; 6:3 : 714–722.

5. Chang J.H., Mellon E., Schanen N.C., Twiss J.L. Persistent TrkA activity is necessary to maintain transcription in neuronally differentiated PC12 cells. J. Biol. Chem. 2003; 278:44: 42877– 42885.

6. Gong Y., Wu J., Qiang H., Liu B., Chi Z., Chen T., Yin B., Peng X., Yuan J. BRI3 associates with SCG10 and attenuates NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells. BMB Rep. 2008; 41:4:287–293.

7. Gudasheva T.A., P.Yu. Povarnina, T.A. Antipova, Yu.N. Firsova, M.A. Konstantinopolsky, S.B. Seredenin. Dimeric dipeptide mimetics of the nerve growth factor Loop 4 and Loop 1 activate TRKA with different patterns of intracellular signal transduction. Journal of Biomedical Science (2015) 22:106. DOI 10.1186/s12929-015-0198-z.

8. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem. 2003; 72: 609–642.

9. Inagaki N., Thoenen H., Lindholm D. TrkA tyrosine residues involved in NGF-induced neurite outgrowth of PC12 cells. Eur J Neurosci. 1995; 7: 6:1125–1133.

10. Kaplan D.R., Miller F.D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 2000; 10: 3: 381–391.

11. Lee M., Tuttle J., Rebhun L., Cleveland D., Frankfurter A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific betatubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motil. Cytoskeleton. 1990; 17: 118–132.

12. Obata K., Noguchi K. MAPK activation in nociceptive neurons and pain hypersensitivity. Life Sci. 2004; 74: 21: 2643–5263.

13. Pollack S.J., Harper S.J. Small molecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factor mimetics. Cur. Drug Targets-CNS and Neurol. Disorders. 2002; 1:1: 59–80.

14. Qian X., Riccio A., Zhang Y., Ginty D.D. Identification and characterization of novel substrates of Trk receptors in developing neurons. Neuron. 1998; 21:5:1017–1029.

15. Rozakis-Adcock M., McGlade J., Mbamalu G., Pelicci G. et al. Association of the Shc and Grb2/Sem5 SH2-containing proteins is implicated in activation of the Ras pathway by tyrosine kinases. Nature. 1992; 360: 6405: 689–692.

16. Senger D.L., CampenotR.B. Rapid retrograde tyrosine phosphorilation of trkA and other proteins in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Cell Biol. 1997; 138: 2: 411–412.

Похожие статьи