Фармакокинетика дипептидного анксиолитика ГБ-115 после перорального введения у различных видов животных и человека
Пт, 10 Нояб 2017
62

Резюме. Представлены результаты изучения фармакокинетики нового дипептидного анксиолитика ГБ-115 на крысах, кроликах и добровольцах. Выявлены существенные межвидовые различия в фармакокинетике ГБ-115 после его перорального введения/ приёма. Так, дозонезависимый параметр - константа скорости элиминации уменьшалась в ряду: крыса > человек > кролик. Период полувыведения ГБ-115, напротив, возрастал в ряду: крыса < человек< кролик.

Ключевые слова: ГБ-115, фармакокинетика, межвидовые различия

Pharmacokinetics of dipeptide anxiolytic GB-115 after oral administration in different animals species and humans 

Raskin S.Yu.1, Kolyvanov G.B.1, Litvin A.A.1, Bochkov P.O.1, Shevchenko R.V.1, Smirnov V.V.2,3, Grybakina O.G.1, Novitskyi A.A.1, Zherdev V.P.1, Kolik L.G.1, Gudasheva T.A.1, Ivashkina N. Yu.4

1 - FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

2 - Sechenov University, Moscow

3 - RC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow

4 - Joint Stock Company «Maluna-Pharm», Moscow

Resume. Results of pharmacokinetic study of a new dipeptide anxiolytic GB-115 in rats, rabbits and volunteers were presented. After oral drug administration significant differences were found. For example, a dose-independent parameter - the elimination rate constant was decreased: rat < human < rabbit. By contrast the half-life of GB-115 was increased: rat<human<rabbit.

Keywords: GB-115, pharmacokinetics, interspecies differences

Автор, ответственный за переписку:

Литвин Александр Алексеевич — д.б.н. ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; e-mail: litbiopharm@yandex.ru

Введение 

Разработка препаратов на основе эндогенных соединений — регуляторных пептидов, является одним из направлений в области создания эффективных и безопасных средств для фармакотерапии психоэмоциональных расстройств. Так, синтезированный аналог тафтсина селанк не уступает по выраженности эффекта медазепаму при лечении пациентов с генерализованными тревожными расстройствами [4], однако, особенности гептапептидной структуры не позволяют использовать его для введения внутрь. С другой стороны, для коротких пептидов установлены переносчик-опосредованные транспортные системы, которые определяют их способность к всасыванию в кишечнике, открывая перспективы создания пептидных препаратов для перорального применения [10].

Основываясь на данных о вовлечённости эндогенной холецистокининовой системы в формировании панических состояний и тревожных расстройств, в

ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» сконструирован дипептидный аналог тетрапептида холецистокинина — амид-N-(6-фенилгексаноил) глицил-N-триптофана (соединение ГБ-115), обладающий антагонистической активностью по отношению к центральным холецистокининовым рецепторам [1] и проявляющий в опытах in vivo выраженный анксиолитический эффект [5], не вызывая при этом толерантности и формирования синдрома «отмены» [6]. На этапе доклинического изучения нового анксиолитика пептидной природы изучен с фармакологической/фармакокинетической точки зрения ряд фармацевтических композиций с целью выявления наиболее оптимальной композиции для получения твёрдой лекарственной формы ГБ-115 [2].

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является изучение его экспериментальной фармакокинетики и метаболизма [7]. Выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике фармакологически активных веществ у экспериментальных животных разных видов позволяет наиболее точно экстраполировать значения фармакокинетических параметров на человека. Анализ доклинических исследований очень важен для оценки вероятности развития и характера побочных эффектов, расчёта начальной дозы для изучения свойств препарата у человека, обеспечивает полезной информацией при переносе данных с животных на человека для выбора пути введения, а также для разработки оптимальной лекарственной формы, обеспечивающей фармакологическую активность и биодоступность.

В то же время при разработке нового препарата невозможно обойтись без клинических исследований, поскольку экстраполяция результатов исследований у животных на человека возможна только в общем виде [8].

Цель исследования — клинико-экспериментальное изучение фармакокинетики нового оригинального дипептидного анксиолитика ГБ-115, выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике у экспериментальных животных и человека.

Материалы и методы

В качестве стандартного вещества использовали фармацевтическую субстанцию ГБ-115 (№ серии ЕК-544-В производства ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», дата выпуска 12.01.2015 г., годен до 02.2018 г.) содержание основного вещества в котором было не ниже 98%. Общая характеристика исследуемого вещества приведена в табл. 1.

Синтез осуществлён в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Крысы

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах (с массой тела 180—220 г), полученных из питомника «Столбовая» (Московская область). Животных содержали по 6 особей в клетке (580x375x200 мм) в стандартных условиях вивария ФБГНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при естественном освещении, постоянной температуре (21—23 °С) и свободном доступе к брикетированному корму и воде. Все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

До проведения исследования крысы находились в течение 12 ч на водной диете. Субстанцию ГБ-115 вводили в виде водной суспензии с добавлением 1% твина 80 перорально в дозе 100 мг/кг. Животных декапитировали до введения препарата и через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 мин после введения суспензии. Плазму крови получали центрифугированием образцов крови животных при 2 500 об/мин в течение 10 мин и 4°С.

Исследование выполнено согласно требованиям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [7].

Кролики

На 6 кроликах-самцах породы шиншилла (питомник «Манихино», Московская область) массой 2,75— 3,10 кг проведено открытое, фармакокинетическое исследование. Животные содержались в стандартных условиях вивария при 12-часовом цикле освещения. За 12 ч до эксперимента животных лишали корма. Кроликам с помощью зонда внутрь вводили субстанцию препарата. Объём суспензии лекарственного средства — 3,0 мл (общая доза ГБ-115 составила 100 мг).

Образцы крови объёмом 1,5 мл отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в конические полиэтиленовые пробирки, предварительно обработанные раствором К2ЭДТА. Взятие образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: до введения препарата (0,0) и через 0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 и 4,0 ч после введения суспензии. Затем полученные пробы крови центрифугировали в течение 10 мин при 2 500 об/мин и 4 °С. Отбор плазмы крови проводили в стерильные пластиковые криопробирки. Плазма крови хранилась при температуре —50 °С.

Добровольцы 

Клиническое исследование ГБ-115 проведено в соответствии с протоколом № КИ 1-2015 «Открытое клиническое исследование I фазы по изучению фармакокинетики, безопасности и переносимости препарата ГБ-115, таблетки 1 мг у здоровых добровольцев при однократном и многократном приёме внутрь» (разрешение МЗ РФ № 600 от 21.10.2015 г.) в условиях стационара Государственного автономного учреждения здравоохранения Ярославской области «Клиническая больница № 2».

После скринингового обследования накануне дня исследования добровольцы находились в стационаре и утром следующего дня под контролем врача-исследователя 3 из 15 добровольцев принимали высшую дозу препарата — 15 мг (таблетки ГБ-115 0,001 г; серия препарата — 10314; производитель — ОАО «Дальхимфарм», Россия). 

Отбор образцов крови

Каждому добровольцу на 8 ч в локтевую вену устанавливали кубитальный катетер.

До приёма препарата, после установки катетера отбирали контрольную пробу крови (0 проба). Образцы крови (10,0 мл) отбирали и переносили в конические полиэтиленовые пробирки (предварительно обработанные К2ЭДТА). Отбор образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0 и 8,0 ч [3].

Пробоподготовка и количественное определение

Исследуемое вещество извлекали из плазмы крови методом осаждения белков. К 250 мкл плазмы крови, содержащей ГБ-115, прибавляли 750 мкл 0,5% раствора муравьиной кислоты в метаноле, тщательно перемешивали. Полученные суспензии центрифугировали при 9 000 g в течение 15 мин при температуре 4°C. Надосадочную жидкость переносили в хроматографические виалы.

Использовали жидкостной хроматограф Surveyor (Thermo scientific, США), оснащённый градиентным насосом, дегазатором, автосамплером, тандемным масс-селективным детектором QQQ Agilent 6460 (Agilent Technologies, США).

Хроматографическое разделение проведено на аналитической колонке Eclipse XDB-C18 (150 х 4,6 мм; 5 мкм), Agilent, США в режиме изократического элюирования. Подвижная фаза: раствор «А» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты до-водили водой деионизованной до общего объёма 1,0 л) и раствор «Б» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты доводили ацетонитрилом до общего объёма 1,0 л) смешивали в соотношении А:Б = 40:60 (об/об).

Скорость потока подвижной фазы — 0,6 мл/мин; объём вводимой пробы — 5 мкл; тип ионизации: электроспрей при атмосферном давлении (+); детектирование: режим множественных молекулярных реакций (MRM); анализируемые переходы: m/z 435,5—>159,0; энергия соударения — 17 эВ; температура капилляра 275 °С; напряжение на капилляре —3000 B.

Для расчёта концентраций ГБ-115 использовался метод абсолютной калибровки по площади пика ГБ-115. Площади пиков оценивались с помощью программы XCalibur (ver. 2.5.6.), Thermo scientific, США, в режиме автоматического интегрирования. Отмечена линейная зависимость между площадью хроматографического пика и концентрацией ГБ-115 в плазме крови в диапазоне 1—50 нг/мл. Предел количественного определения методики составил 1 нг/мл.

Методику валидировали по следующим параметрам: селективность, диапазон применения (верхний и нижний пределы количественного определения), линейность, правильность и прецизионность, стабильность.

Для расчётов фармакокинетических параметров был использован модельно-независимый метод [3].

В таблицах представлены средние арифметические значения величин (х), стандартные отклонения (SD), коэффициент вариации (C.V.%).

Все процедуры в исследовании выполнены согласно стандартным операционным процедурам (СОП) лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и соответствующим нормативным актам.

Результаты и их обсуждение

Фармакокинетические исследования на крысах 

Хромато-масс-спектрометрический анализ всех образцов плазмы крови показал, что в анализируемых образцах присутствует характеристический молекулярный ион, соответствующий неизмененной молекуле ГБ-115.

На рис.1 представлена усредненная фармакокинетическая кривая ГБ-115 в плазме крови крыс после однократного перорального введения ГБ-115 в виде суспензии (доза 100 мг/кг). Поскольку на каждую временную точку использовали по 6 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усреднённым концентрациям, поэтому при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Как видно из рис. 1, ГБ-115 быстро всасывался из ЖКТ в системный кровоток и определялся в плазме крови уже через 5 мин после введения. Максимальная концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс (146,16 нг/мл) достигалась через 0,17 ч (10 мин) после введения препарата. Соединение ГБ-115 достаточно быстро выводится из организма животных. Об этом свидетельствуют значения следующих фармакокинетических параметров: период полувыведения исследуемого вещества составил 0,24 ч, а среднее время удерживания (MRT) ГБ-115 в организме животных — 0,28 ч. При этом величина плазменного клиренса (Cl/F) исследуемого вещества составила 2,11 л/ч/кг (табл. 2).

Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объём распределения (Vd/F). Его величина составила 0,74 л/кг. Кажущийся объём распределения обычно не эквивалентен анатомическому объёму, а отражает распределение препарата и степень его связывания в организме. Так, если препарат связывается преимущественно белками крови, Vd/F будет меньше, чем реальный. С другой стороны, преимущественное связывание препарата во внесосудистом пространстве приводит к превышению значения Vd/F над реальным. В нашем случае расчёт величин Vd/F дал значительно большие результаты, указывающие, что ГБ-115 распределяется во всех жидких средах организма животных [9].

На рис. 2 представлен усредненный фармакокинетический профиль ГБ-115 в плазме крови кроликов после однократного перорального введения субстанции в дозе 100 мг. Тестируемое вещество определялось в биожидкости на протяжении 4 ч. Снижение концентраций ГБ-115 после достижения максимальных концентраций носило монофазный характер.

В табл. 3 представлены основные фармакокинетические параметры ГБ-115 у кроликов после однократного введения внутрь субстанции. Время наступления максимальной концентрации анализируемого вещества в плазме крови (Tmax) составило 0,71 ± 0,10 ч. Уровень максимальной концентрации в плазме крови животных (Cmax) в среднем составил 191,50 ± 39,16 нг/мл. При этом среднее значение константы скорости элиминации (kel) ГБ-115 из плазмы крови кроликов составило 0,548 ± 0,133 ч-1, а период полуэлиминации (ti/2el) ГБ-115 из плазмы крови — 1,32 ± 0,30 ч. MRT ГБ-115 в организме животных равнялось 1,65 ± 0,38 ч.

На рис. 3 представлены индивидуальные фармакокинетические профили ГБ-115 в плазме крови добровольцев после однократного перорального приёма таблеток ГБ-115 в дозе 15 мг.

Из рис. 3 видно, что снижение концентраций исследуемого лекарственного вещества после достижения пиковых значений имеет монофазный характер. ГБ-115 определялся в плазме крови всех 3 добровольцев в течение 6 ч после приёма препарата.

В табл. 4 представлены фармакокинетические параметры ГБ-115 в плазме крови добровольцев после однократного приёма таблеток ГБ-115 в дозе 15 мг.

Анализ фармакокинетических параметров показал, что ГБ-115 всасывался в системный кровоток из ЖКТ добровольцев с разной скоростью. Параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток Cmax/AUC0-T, изменялся от 0,4838 до 0,6477 ч—1. При этом время достижения Cmax — Tmax ГБ-115 в плазме крови изменялось от 0,75 до 2,0 ч и в среднем составило 1,42 ± 0,63 ч.

Величины Cmax изменялись от 29,72 до 55,89 нг/мл (44,02 ± 13,25 нг/мл).

ГБ-115 достаточно быстро выводится из плазмы крови. Так, период полувыведения (t1/2el) исследуемого вещества колебался от 0,83 ч до 1,17 ч и в среднем составил 0,98 ± 0,17 ч. Быстрое выведение препарата из организма характеризуется также величиной MRT. Величина данного параметра изменялась от 1,56 ч до 2,38 ч (2,04 ± 0,43 ч).

Общий плазменный клиренс (Cl/F) ГБ-115 находился в диапазоне значений 1,367—3,734 л/ч/кг (2,643 ± 1,194 л/ч/кг).

Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объём распределения (Vd/F). Его величина для ГБ-115 после перорального введения в дозе 15 мг составила в среднем 3,60 ± 1,42 л/кг (2,31—5,12 л/кг).

Представляется целесообразным сравнить фармакокинетические характеристики ГБ-115 у животных разных видов и человека. Причём, следует сравнивать параметры, которые не зависят от введённой дозы, поскольку исследуемые дозы у животных и добровольцев отличались друг от друга на два порядка (100 мг/кг — для крыс и около 0,2 мг/кг — для добровольцев). Прямое сопоставление полученных значений, на наш взгляд, некорректно, поскольку отсутствует доказательство линейной зависимости фармакокинетики ГБ-115 в этом диапазоне доз.

Рассчитанные дозонезависимые фармакокинетические параметры у крыс, кроликов и человека после перорального введения ГБ-115 представлены в табл. 5.

При сравнении этих параметров ГБ-115 у крыс и кроликов выявлены межвидовые различия.

Так, параметр, характеризующий скорость всасывания препарата Cmax/AUC0-T из ЖКТ крыс в среднем составил 3,0794 ч—1 и для кроликов — 0,5201 ч—1. Таким образом, ГБ-115 всасывался в системный кровоток крыс в 6 раз быстрее, чем у кроликов. Выведение препарата из плазмы крови крыс и кроликов также происходило с различными скоростями (для крыс t1/2el — 0,24 ч и для кроликов — 1,32 ч, MRT — 0,28 и 1,65 ч, соответственно). Об этом также свидетельствуют величины kel. Так, данный параметр у крыс составил 2,8424 ч-1, у кроликов — 0,5481 ч-1. Другими словами, выведение ГБ-115 из организма кроликов происходило в 5 раз медленнее, чем у крыс.

Фармакокинетические параметры ГБ-115, рассчитанные для добровольцев значительно отличалась от таковых, полученных для крыс. В то же время, при сравнении параметров, полученных у добровольцев и кроликов выявлены незначительные расхождения. Исследуемое соединение всасывалось из ЖКТ в системный кровоток у кроликов и добровольцев с одинаковой скоростью (0,5201 и 0,5275 ч-1, соответственно). Среднее значение kel у добровольцев была на 30% выше аналогичного параметра у кроликов.

t1/2el ГБ-115 из плазмы крови добровольцев составил 0,98 ч, что на 30% меньше, чем у кроликов (1,32 ч). Аналогичная зависимость прослеживается при сопоставлении значений MRT добровольцев, крыс и кроликов.

После однократного перорального введения Cmax ГБ-115 в плазме крови крыс регистрировались через 0,17 ч, у кроликов - 0,71 ч и через 1,42 ч - у добровольцев.

Заключение 

Выявлены существенные межвидовые различия в фармакокинетике ГБ-115 после его перорального введения/приёма у крыс, кроликов и человека. Так, дозонезависимый параметр - константа скорости элиминации уменьшалась в ряду: крыса > человек > > кролик. Период полувыведения ГБ-115, напротив, возрастал в ряду: крыса < человек < кролик.

Литература

1. Гудашева Т.А., Лезина В.П., Кирьянова Е.П. и соавт. Синтез, конфармицонный анализ и анксиолитическая активность ретропептидных аналогов холецистокинина-4. Хим.-фарм. Журнал. 2016; 50:5: 42-46.

2. Жердев В.П., Бойко С.С., Константинопольский М.А. и соавт. Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических композиций дипептидного анксиолитика ГБ-115. Хим.-фарм. Журнал. 2016; 50:5: 42-46.

3. Жердев В.П., Колыванов Г.Б., Литвин А.А. и соавт. Клиническая фармакокинетика оригинального дипептидного анксиолитика ГБ-115. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2017; 1: 52-55.

4. Зозуля А.А., Незнамов Г.Г., Сюняков Т.С. и соавт. Эффективность и возможные механизмы действия нового пептидного анксиолитика селанка при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2008; 108: 4: 38-48.

5.           КоликЛ.Г. Разработка оригинального анксиолитика с антиалко¬гольной активностью на основе фармакологического изучения новых производных холецистокинина. Дисс. д-ра. биол. наук, Москва: НИИ фармакологии имени В.В. Закусова, 2012; 340.

6.           Колик Л.Г., Гарибова Т.Л., Литвинова С.А. и соавт. Отсутствие толерантности и синдрома отмены у нового L-триптофансодержащего дипептидного анксиолитика ГБ-115. Вестник РАМН. 2011; 7: 37-42.

7.           Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. А.Н. Миронов (ред.), ЗАО «Гриф и К», Тула, 2013; 942.

8.           Шевченко Р.В. Клинико-экспериментальная фармакокинетика нового дипептидного препарата дилепт. Автореф. Дисс. канд. мед. наук, М.: 2016; 24.

9.           Davies B., Morris Т. Physiological parameters in laboratory animals and humans. Pharm Res. 1993; 10: 7: 1093-1095.

10.         Liu Z., Wang C., Liu Q. et al. Uptake, transport and regulation of JBP485 by PEPT1 in vitro and in vivo. Peptides. 2011; 32: 4: 747-754.

Похожие статьи