Исследование биоэквивалентности препаратов ондансетрона с использованием метода ВЭЖХ-МС
Ср, 16 Сен 2015
3525

1 — ФГАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», Центр коллективного пользования, г. Москва

2 — ФБУН СЗНЦ «Гигиены и общественного здоровья», г. Санкт-Петербург

Резюме. В рамках перекрёстного, открытого, рандомизированного исследования с недельным периодом отмывки, с двумя последовательностями была изучена биоэквивалентность двух таблетированных форм ондансетрона на 18 добровольцах (дозировка 8 мг). Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС, с внутренним стандартом — трописетроном. Предел количественного определения составил 1 нг/мл.

Для анализируемых препаратов рассчитаны фармакокинетические параметры: AUC0-t, Cmax, Tmax, MRT, Cmax/AUC. 90% доверительный интервал для логарифмически преобразованных значений AUC0-t составил 0,9507 — 1,0037, для AUC(0-∞) 0,9402-0,9974 и для Cmax — 0,9255 — 1,0095. По результатам исследования сделан вывод о биоэквивалентности сравниваемых препаратов ондансетрона.

Ключевые слова: ондансетрон, трописетрон, ВЭЖХ/МС, валидация, фармакокинетика, биоэквивалентность

Bioequivalence study of ondansetron tablets by HPLC-MS

Stepanova E.S.1, Ovcharov M.V.1, Barsegyan S.S.1, Nikonova S.M.2, Shilov V.V.2, Chistyakov V.V.1 1 — Peoples’ Friendship university of Russia, Shared Research and Education Center, Moscow

2 — Science Center «Hygiene and Public Health», St-Petersburg

Abstract. Within the cross, a single, open, randomized study with a week washout period, the two sequences has been studied bioequivalence of tablet forms two ondansetron 18 volunteers (8 mg dosage). Plasma samples were analyzed by a validated HPLC-MS, tropisetron was used as the internal standard. Limit of quantification was 1 ng/ml.

Analyzed  for  drugs  following  pharmacokinetic  parameters  were  calculated:  AUC0-t,  Cmax, Tmax,  MRT,  Cmax/AUC.

90% confidence interval for log-transformed values of AUC0-t was 0,9507 — 1,0037, of AUC(0-∞) was 0,9402-0,9974, of Cmax was 0,9255 — 1,0095. The study concluded that bioequivalence compared ondansetron drugs.

Keywords: ondansetron, tropisetron, HPLC/MS, validation, pharmacokinetics, bioequivalence

Автор, ответственный за переписку:

Степанова Елена Сергеевна — ФГАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», Центр коллективного пользования, г. Москва; адрес: Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2; e-mail: stepanova_25@inbox.ru; тел.: +7 (985) 442-17-49

 

Введение

Значительные успехи химиотерапии в последние годы основываются на развитии   поддерживающей и сопроводительной терапии, что позволило сделать лечение пациентов с онкологическими заболеваниями более эффективным. Практически весь спектр цитостатических препаратов имеет ряд выраженных побочных эффектов. Тошнота и рвота относятся к наиболее

частым осложнениям при проведении химиотерапии. Ещё совсем недавно около 10% больных отказывались от химиотерапии или прерывали её преждевременно из-за развития непереносимой тошноты и рвоты [1]. Ключевую роль в развитии острой тошноты и рвоты играет нейромедиатор — серотонин (5—НТ), высвобождение которого происходит при воздействии лучевой терапии или введении цитостатических препаратов из энтерохромаффинных клеток слизистой тонкой кишки.

Разработка и внедрение в широкую практику в начале 1990 г. антагонистов рецепторов 5—НТ3 позволили кардинально уменьшить тошноту и рвоту при проведении химиотерапии. За счёт селективного действия, эти препараты практически полностью купируют тошноту и рвоту, имея при этом минимальные побочные эффекты [2].

Антагонисты 5-HT3 рецепторов стали препаратами выбора среди противорвотных средств [3]. Внутри класса антагонистов 5-HT3 рецепторов существенных различий между препаратами в отношении их эффективности не выявлено [4].

Выбор препарата лечения основывается на индивидуальных особенностях пациентов. Ондансетрон — один из представителей группы антагонистов 5-HT3 рецепторов успешно применяется в клинической практике для купирования тошноты и рвоты развивающейся на фоне химиотерапии, лучевой терапии, а также тошноты и рвоты возникающей в послеоперационный период.

 

Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение биоэквивалентности препаратов Ондавелл, таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 8 мг («ПТ. Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия).

 

Материалы и методы 

 

Оборудование

Высокоэффективный   жидкостной   хроматограф «Dionex ultimate 3000» (ФРГ), с масс-детектором Bruker micrOTOF-Q II (ФРГ).  Весы аналитические «MX5» «Mettler Toledo» (Швейцария).

Дозаторы переменного объёма на 50,0, 200,0 Колор «Ленпипет» (РФ) 1000,0; и 5000,0 мкл «Biohit» (Финляндия) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками «Экохим» (РФ); аппарат для встряхивания жидкости «Genius 3», «Vortex» (США); центрифуга Centrifuge 5424, Eppendorf (ФРГ); пробирки Эппендорфа «Экохим» (РФ); калиброванные мерные колбы вместимостью 50; 100; 250; 1000 мл (ГОСТ 1770-74), мерные цилиндры объёмом 50, 250, 1000 мл (ГОСТ 1770-74).

 

Реактивы и растворы

Субстанция ондансетрона гидрохлорида 92,16% (Sun Pharma), субстанция трописетрона гидрохлорида, ацетонитрил 99,9% (LabScan), ацетат аммония 99% (Fluka), кислота муравьиная 50% (Fluka), аргон 99,95%, азот (Dominick Hunter) 99 %, вода Milli-Q.

 

Пробоподготовка

В пробирку Эппендорфа 1,5 мл отбирали 200 мкл плазмы, белки осаждали 400 мкл ацетонитрила, содержащего 10 нг/мл трописетрона (ТР) — внутренний стандарт. Раствор перемешивали 5 с на вихревой мешалке. Образец центрифугировали 3 мин при 14000 об/мин. 400 мкл супернатанта отбирали в 1,5 мл флаконы, прибавляли 400 мкл воды и помещали в термостат автосамплера при 10°С для последующего хроматографического анализа.

 

Методика количественного определения

Для количественного определения ондансетрона в плазме крови добровольцев при исследовании биоэквивалентности использован валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/ МС) [5].

 

Хроматографические условия:

  • колонка XDB-С18 5 мкм 4,6×150 мм
  • элюент — раствор 0,05% муравьиной кислоты и ацетонитрил в соотношении 25:75
  • поток подвижной фазы — 0,6 мл/мин
  • объём вводимой пробы — 50 мкл

 

Условия масс-детектирования:

Масс-детектор напряжение на игле - 5500 В, температура источника 220°C, расход осушающего газа 6 л/мин, давление распыляющего газа 1,5 бар.  Ионизация электрораспылением, регистрация положительных ионов, целевой ион ОНД 294,15±0,1 и ТР 285,15±0,1. Время удерживания ТР в этих условиях 4,21 мин, ОНД — 4,84 мин.

Скорость записи спектров 1 Гц. Общее время анализа 5,5 мин. Через каждые 50 анализов производилась промывка хроматографической   системы   в   течении 40 мин при потоке 1 мл/мин, градиент: [% ацетонитрила]                25→0→0→100→100→25→25, время [мин] 0→1→5→20→25→27→40.

 

Дизайн клинического этапа исследования

 

 

Расчёт фармакокинетических параметров

Для обсуждения биологической доступности лекарственных средств рассчитывали концентрации ондансетрона в плазме крови и определяли фармакокинетические параметры:

  • максимальная концентрация (Cmax) — максимальное значение из измеренных;
  • время достижения максимальных концентраций (Тmax) — время, при котором измерялась Cmax;
  • площадь под фармакокинетической кривой — в пределах длительности наблюдений (AUC0-t) рассчитывают методом трапеций;
  • площадь под кривой в интервале времени от 0 до ∞ (AUC0-∞)
  • среднее время удержания препарата в организме (MRT);
  • значение Сmax/AUC0-t, отражающее скорость всасывания.

Фармакокинетические параметры рассчитывали на компьютере Pentium 4 с использованием программ «Bioeqv», статистическая обработка данных проведена с использованием «Excel», графика — «SigmaPlot».

 

Результаты

Калибровочная кривая

Диапазон концентраций для калибровочной кривой выбрали в пределах от 1,0 до 50,0 нг/мл (рис. 1). Коэффициент корреляции R для кривой составил 0,9944. Калибровочная кривая описывалась уравнением y=0,070332×x0,014394, где х — концентрация ОНД, у — отношение площадей хроматографических пиков ОНД к ТР.

 

Валидация методики

Методика количественного определения ОНД была валидирована по нескольким параметрам, представленным в табл. 2, для доказательства её пригодности для исследований биоэквивалентности [6].

 

Основные фармакокинетические параметры и статистическая обработка данных

Усреднённые графики изменения концентрации ОНД в плазме крови добровольцев после приёма тестируемого и референтного препаратов представлены на рис. 6 (ср. значения ±90% дов.инт., n=18). Видно, что профили концентраций ондансетрона после применения таблеток Ондавелл «ПТ Новелл Фармасьютикал Лабораториз» (Индонезия) повторяют профили концентраций ондансетрона при использовании таблеток референспрепарата Эметрон® «Гедеон Рихтер А.О.» (Венгрия).

Рассчитанные основные фармакокинетические параметры представлены в табл. 3. Максимальные концентрации регистрируются спустя, в среднем, 2,14-2,33 ч после приёма препаратов и составляют для тестируемого препарата (x ±C.I. 90%) 25,42±3,82 нг/ мл, для препарата сравнения — 27,60±4,13 нг/мл. Параметр среднего времени удерживания (MRT) составил, соответственно, 4,62±0,17 и 4,83±0,21 ч. Нет достоверных различий и в параметре AUC, отражающем степень всасывания. Для тестируемых таблеток AUC0-12 (AUC0- ) — 138,93±19,97 (140,40±20,45), для препарата сравнения — 153,15±21,95 (160,19±22,37) нг/мл×ч. Отношения максимальных концентраций к площадям под фармакокинетическими кривыми Сmax/AUC0-12, отражающие скорость всасывания, для сравниваемых лекарственных препаратов, практически одинаковы и составили 0,183±0,010 (тест препарат) и 0,181±0,010 (препарат сравнения).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Для установления статистически значимых различий между препаратами проводили дисперсионный анализ значений Cmax, AUC0-t после их логарифмического преобразования (табл. 4).

Для установления статистически значимых различий между средними значениями показателя биоэквивалентности сравниваемых препаратов значение F для строки «препарат» (различия между препаратами) должно превзойти соответствующее табличное значение (таблица критерия Фишера для числа степеней свободы (1; n-2) и выбранного уровня значимости α).

Критическим значением для оценки вклада факторов типа препарата является значение F0,05;1;16 = 4,49. Как можно видеть, F-отношение для вклада фактора типа препарата нигде не превосходит этого критического значения.                         

Оценка биоэквивалентности изучаемых препаратов проводилась по показателям: AUC0-t, AUC0- , Сmax. В табл. 5 приведены границы 90% доверительного интервала для логарифмически преобразованных рассчитанных фармакокинетических параметров: AUC(0-t) 95,07%-100,37%; для AUC (0-∞) 94,02%-99,74%, для Сmax 92,55%-100,95%.    

           

Выводы                                        

Значения всех определяемых параметров статистически достоверно не различались. Дисперсионный анализ значений lnAUC0-12, lnCmax, проведённый после их логарифмического преобразования, не выявил статистически значимых различий между препаратами. Границы оценённого 90% доверительного интервала для индивидуальных отношений логарифмически преобразованных значений (табл. 4) находятся в допустимых пределах: 80-125% для AUC0-12 и AUC0-∞ и 75-133% для Cmax [7].                   

Таким образом, препарат Ондавелл, таблетки, покрытые пленочной оболочкой,  8  мг  («ПТ.  Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и препарат Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой, 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия) биоэквивалентны.

 


 

Литература

  1. Kris M.G., Hesketh P.J., Herrstedt J., Rittenberg C., Einhorn L.H., Grunberg S. et al. Consensus proposals for the prevention of acute and delayed vomiting and nausea following high — emetic — risk chemotherapy. // Support Care Cancer 2005, Vol. 13:85—96.
  2. Oge A., Alkis N., Oge O., Kartum A. Comparison of granisetron, ondansetron and tropisetron for control of vomiting and nausea induced by cisplatin. // J Chemother 2000, Vol. 12(1):105-108.
  3. Steven M. Grunberg, and Paul J. Hesketh. Control of Chemotherapy—Induced Emesis. // The New England journal of medicine, 1993, Vol. 329:1790—1796.
  4. Stiakaki E., Savvas S., Lydaki E., Bolonaki I., Kouvidi E., Dimitriou H., et al. Ondansetron and tropisetron in the control of nausea and vomiting in children receiving combined cancer chemotherapy. // Pediatr Hematol Oncol. 1999, Vol. 16(2):101-108.
  5. Yara Popst Armando, Simone Grigoleto Schramm, Marina de Freitas Silva, Eunice Kazue Kano. Bioequivalence assay between orally disintegrating and conventional tablet formulations in healthy volunteers. // International Journal of Pharmaceutics, 2009, Vol. 366, 149—153.
  6. Guideline on bioanalytical method validation. // European Medicines Agency, 2011.
  7. Методические рекомендации «Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств, гл. 7 в «Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. — М.: Гриф и К, 2013.

 

Похожие статьи