Исследование сравнительной биоэквивалентности препаратов Пиоглитазон таблетки, 20 мг (АО «Химфарм», Республика Казахстан) и Актос® таблетки, 30 мг («Eli Lilly Holdings, Takeda Global Research and Development Centre Europe Ltd»)
Пн, 30 Нояб -0001
1653

Резюме

В рамках перекрёстного, однократного, открытого, рандомизированного исследования с двухнедельным периодом отмывки, с двумя последовательностями была изучена биоэквивалентность двух таблетированных форм пиоглитазона на 18 добровольцах (дозировка 30 мг). Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС/МС в течение 48 часов. Для анализируемых препаратов рассчитаны следующие фармакокинетические параметры: AUC0-t, Cmax, tmax, Cmax/AUC. 90% доверительный интервал для логарифмически преобразованных значений AUC0-t составил 0,945 – 1,066 и для Cmax – 0,871 – 1,044. По результатам исследования был сделан вывод о биоэквивалентности сравниваемых препаратов пиоглитазона.

Ключевые слова: Пиоглитазон, Актос®, фармакокинетика, биоэквивалентность

Введение

Современная стратегия ведения пациентов с сахарным диабетом (СД) 2–го типа предполагает, помимо долгосрочного гликемического контроля, обязательную коррекцию факторов риска развития макро– и микрососудистых осложнений. Препараты из группы тиазолидиндионов, в частности пиоглитазон характеризуются мощным сахароснижающим действием, а также способствуют уменьшению выраженности факторов риска осложнений сердечно–сосудистых заболеваний: инсулинорезистентности (ИР), артериальной гипертензии и дислипидемии. ИР рассматривается в настоящее время как основополагающее патофизиологическое нарушение в развитии СД 2–го типа, и, соответственно, коррекция ИР приобретает ведущую роль в терапии СД 2–го типа.

Целью настоящего исследования являлась оценка биоэквивалентности генерического препарата пиоглитазон таблетки 30 мг, производства АО «Химфарм» (Республика Казахстан) в сравнении с зарегистрированным на территории Республики Казахстан препаратом Актос® таблетки 30 мг, производства «Eli Lilly Holdings, Takeda Global Research and Development Centre Europe Ltd» после однократного их приёма испытуемыми.

Пиоглитазон

5-[[4-[2-(5-Этил-2-пиридинил)этокси] фенил]метил-2,4-тиазолидиндион (в виде гидрохлорида)

Материалы и методы исследования

Исследуемые препараты

В качестве тест-препарата (Тест; Т) использовали Пиоглитазон, таблетки, содержащие 30 мг пиоглитазона (производитель – АО «ХИМФАРМ», Республика Казахстан), в качестве препарата-сравнения (Референс; R) использовался препарат Актос®, таблетки, содержащие 30 мг пиоглитазона («Eli Lilly Holdings, Takeda Global Research and Development Centre Europe Ltd»).

Дизайн исследования

Дизайн исследования соответствовал утверждённому протоколу исследования (№ BEq-Piog-01-2013, Версия 1.0 от «21» январь 2013 г.), а также требованиям «Надлежащей клинической практики» (GCP) [2-5, 9]. 18 здоровых волонтёров молодого возраста мужского (№=6) и женского (№=12) пола (возраст – 31,4±6,6, массы тела – 67,5±8,5) после подписания информированного согласия были направлены в клиническую базу РГКП «Республиканский научно-практический центр психиатрии, психотерапии и наркологии» МЗ РК. Там они были разделены на 2 группы случайным образом, согласно схеме рандомизации. Все участники были проверены на наличие наркотических веществ и алкоголя, кроме того, волонтёрам женского пола был проведён тест на беременность. Общий анализ крови, биохимия и ЭКГ были проведены дважды: до начала исследования и в последний визит (в конце второго этапа исследования). В оба периода исследования участники находились в исследовательском центре непрерывно в течение 48 часов. Период «отмывки» (wash-out) между этапами составлял 21 дней (1 этап – 05.05.2013; 2 этап – 27.05.2012). На обоих этапах исследования отбор образцов крови (5 мл) производился: до введения дозы (0 часов), и в течение 48 часов после введения препарата. Взятие образцов крови для последующего определения содержания активного метаболита пиоглитазона – пиоглитазоната в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени 0; 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 12, 24 и 48,0 после приёма препаратов. Перед каждым отбором крови больной находился в течение 5 минут в лежачем положении. Кровь была взята из локтевой вены (с нулевого фона до 4 часов, путём катетеризации локтевой вены) и с 6 по 48 ч. одноразовыми шприцами в количестве 5-10 мл в стеклянные пробирки с добавлением гепарина. Образцы крови отстаивались в течение 15 минут в условиях комнатной температуры, затем путем центрифугирования (3000 об/мин в течение 10 минут) получали плазму крови. Плазма хранилась при температуре -24°С. Приготовление стандартных растворов пиоглитазоната осуществлялось в плазме крови.

Аналитический метод

Для количественного определения пиоглитазона применяли метод [10] с модификациями.

Растворители, реактивы и материалы

Все реактивы, использованные в работе, имели характеристики чистоты не ниже х.ч., растворители имели маркировку HPLC-grade.

Приготовление образцов для анализа

Для приготовления растворов стандартных образцов использовали субстанции стандартов пиоглитазона (производитель «Zhejiang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd», Китай, серия D-5031-11-006m1, срок годности 07.2013) и росиглитазона (производитель «Sigma-Aldrich», США, серия R2408, CAS Number 122320-73-4). Для количественного определения готовили маточные растворы стандартов пиоглитазона и росиглитазона в метаноле с концентрациями 1 мг/мл. Раствор пиоглитазона применяли для приготовления растворов рабочих стандартных образцов на плазме крови с концентрациями 0,039 мкг/мл; 0,078 мкг/мл; 0,156 мкг/мл; 0,3125 мкг/мл; 0,625 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл. Раствор внутреннего стандарта с концентрацией 1 мг/мл разбавляли в 50 раз для получения рабочего раствора росиглитазона с концентрацией 20 мкг/мл. Определение концентрации пиоглитазоната проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Экстракция пиоглитазона из плазмы крови

Жидкостную экстракцию пиоглитазона и росиглитазона осуществляли согласно Zhang H. et al., 2004 г.: к 0,5 мл плазмы с содержащимися в ней аналитом добавляется 50 мкл раствора внутреннего стандарта с концентрацией 20 мкг/мл для достижения конечной концентрации 2 мкг/мл. Затем плазму крови подщелачивали 0,5 мл 0,1 M K2HPO4, образец перемешивали. Далее к образцу добавляли 5 мл этилацетата, полученную смесь встряхивали на вибромиксере на скорости 2000 r.p.m. в течение 5 минут. Далее образцы центрифугировали для разделения слоёв в течение 5 минут, надосадочный органический слой декантировали и упаривали в вакуумном центрифужном концентраторе при температуре 60°С. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл метанола и инжектировали в петлю хроматографа в объёме 5 мкл.

Хромато-масс-спектрометрический анализ

Насос – «Finnigan Surveyor LC Pump Plus». Детектор – масс-спектрометрический детектор «LCQ Fleet MS» (квадрупольная ионная ловушка). Аналитическая колонка – Hypersil Gold C18 фирмы Thermo Electron Corp., США (100´4,6 мм; 5 мкм). Подвижная фаза состояла из двух растворов: 10 мМ ацетат аммония (раствор А) и ацетонитрил – 10 мМ ацетат аммония (90:10) (раствор Б), взятых в соотношении 25%A:75%Б, работа проводилась в изократическом режиме элюирования. Скорость потока подвижной фазы 0,6 мл/мин. Объём пробы – 5 мкл. Температура разделения 250С. Продолжительность хроматографирования – 7 минут. Время удерживания аналита – 2,98 мин. Время удерживания внутреннего стандарта (росиглитазона) – 3,02 мин. Детектирование: масс-спектрометрическое, по дочернему иону с m/z 134,0 образующемуся в результате распада молекулярного иона Пиоглитазона с m/z 357,2 при нормализованной энергии соударений 25 eV (масс-спектр второго порядка для Пиоглитазона представлен на рис. 1). Внутренний стандарт (росиглитазон) детектировали по дочернему иону с m/z 135,0 образующемуся в результате распада молекулярного иона росиглитазона с m/z 358,3. Масс-спектрометр работал в режиме регистрации ионов, положительно заряженных электроспреем (ESI), создаваемым напряжением в 5 кВ. Скорость потока газа-небулайзера (азота): 5 л/мин, давление на распылителе – 100 psi. Температура интерфейса капилляра составляла 350°С, температура нагревателя – 300°С. Амплитуда возбуждения на концевых электродах ловушки 0,1 В. Детектирование проводилось в режиме полного сканирования МС/МС – Full Scan ms2, в диапазоне m/z 80-600. В качестве демпфирующего газа в ионной ловушке использовался гелий. Данные обрабатывались с помощью Xcalibur 2.1 w/Foundation 1.0.1.

А

 

Б

 

Рис. 1. Масс-спектры второго порядка для пиоглитазона (А) и росиглитазона (Б)

Метод количественного определения: отношение площадей хроматографических пиков аналита и внутреннего стандарта – концентрация. Метод внутреннего стандарта.

Регрессия: линейная. Метод наименьших квадратов.

Диапазон калибровки: 0,039 – 5 мкг/мл. Точность количественного определения Пиоглитазона представлена в табл. 1.

Таблица 1

Точность количественного определения Пиоглитазона в течение рабочего дня

Концентрация мкг/мл

%C.V.

%dev

n

0,156

5,20

10,02

6

0,625

3,94

3,85

6

2,5

2,11

-1,84

6

Предел количественного определения – 0,039 мкг/мл

Специфичность определения Пиоглитазона: установлено, что матричные эффекты коэкстрактивных веществ из плазмы крови не мешают определению Пиоглитазона и внутреннего стандарта. Типичные хроматограммы интактной плазмы крови, образца Пиоглитазона с концентрацией 2,5 мкг/мл и плазмы крови с концентрацией Пиоглитазона 0,625 мкг/мл представлены ниже (рис. 2а, б, в).

 

а – Хроматограмма экстракта интактной плазмы крови (верхнее окно – MS1 m/z 100-800, среднее окно – MS2 Пиоглитазона, нижнее окно - MS2 росиглитазона).

б – Хроматограмма стандартного раствора Пиоглитазона с концентрацией 2,5 мкг/мл.

в – Хроматограмма экстракта плазмы крови с концентрацией пиоглитазона 0,625 мкг/мл, верхний пик – пик аналита, нижний пик – пик внутреннего стандарта.

Рис. 2. Хроматограммы экстрактов плазмы крови

Количественный анализ

Калибровочная кривая представлена на рис. 3. Градуировочная зависимость пиоглитазона в плазме крови описывалась формулой: С= 2,132×AR, где С – концентрация пиоглитазона (мкг/мл), AR (Area Ratio) – отношение площадей пиков аналита и внутреннего стандарта. Коэффициент корреляции составил R2 = 0.9986, что соответствует аналитической аппроксимации.

Рисунок 3. Калибровочная кривая пиоглитазона в плазме крови (в мкг/мл).

Предел количественного определения – 0,039 мкг/мл.

Точность и воспроизводимость

Точность выражалась в виде коэффициента вариации (%C.V.) для каждой серии образцов согласно уравнению:

, где

SD – стандартное отклонение серии определений;

`x – среднее арифметическое значение полученных концентраций.

 

Воспроизводимость измерялась, как процент отклонения (%dev.) от теоретического значения по формуле: , где

 `x – среднее арифметическое значение полученных концентраций;

 `m – теоретическая концентрация.

           

Метрологическая характеристика среднего результата

 – среднее арифметическое значение полученных концентраций;

SD – стандартное отклонение;

 – стандартное отклонение среднего результата;

 – полуширина доверительного интервала (р=0,95);

– ошибка среднего результата.

 

Точность в течение рабочего дня

Каждый из образцов, предназначенных для контроля качества, анализировали в течение 1 рабочего дня (6 определений). Также провели контроль во время исследования и после его окончания. Для 0,156 мкг/мл средняя точность составила 5,20%C.V. и 10,02%dev. Остальные пробы с концентрациями 0,625 и 2,5 мкг/мл имели точность от 2,11 до 3,94%C.V. Воспроизводимость колебалась от -1,84 до 3,85%dev.

ЧИТАЙТЕ ДАЛЕЕ СТАТЬЮ В PDF

 

Похожие статьи