Поиск селективных блокаторов цинк-зависимых металлопротеиназ 2-го и 9-го типа в ряду бензоиламино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот
Сб, 07 Янв 2017
378

Резюме. Цель настоящего исследования - поиск в ряду бензоиламино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот биологически активных соединений, обладающих свойствами блокаторов, цинк-зависимых металлопротеиназ 2-го и 9-го типа, которые, как известно, играют ключевую роль в патогенезе раннего постинфарктного ремоделирования миокарда. При изучении влияния вновь синтезированных соединений на уровень экспрессии металлопротеиназы-9 в крови крыс с острым инфарктом миокарда было отобрано соединение-лидер - 1-({4-[(4-хлорбензоил) амино]фенил}сульфонил-L-пролин, - которое эффективно блокирует повышения уровня этого фермента в крови. При помощи эхокардиографии показано, что отобранное соединение-лидер по своей способности препятствовать развитию ремоделирования миокарда в острейшую фазу экспериментального инфаркта миокарда, как минимум, не уступает эталонному ингибитору металлопротеиназ - доксициклину.

Ключевые слова: металлопротеиназы 2-го и 9-го типа, постинфарктное ремоделирование миокарда, производные бензоила- мино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот

Search selective blockers of the zinc-dependent metalloproteinases 2nd and 9th type among the benzoylamino (phenylsulfonyl) amino-substituted cyclic aminoacids derivatives

Kryzhanovskii S.A., Mokrov G.V., Grigorkevich O.S., Tsorin I.B., StoLyaruk V.N., Vititnova M.B., Likhosherstov A.M., Gudasheva T.A.

FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

Abstract. The purpose of this study - search among the benzoylamino (phenylsuLfonyl) amino-substituted cyclic aminoacids derivatives biologically active compounds exhibiting properties of the zinc-dependent metallproteinases 2nd and 9th type blockers which is known to play a key role in the pathogenesis of the myocardium early post-infarction remodeling. In studying the effect of newly synthesized compounds on metalloproteinase-9 Levels in blood of rats with acute myocardial infarction were selected compound leader: 1-({4-[(4-chlorobenzoyl)amino]phenyl}sulfonyl-l-proline, which effectively blocked the increase of this enzyme level. Using echocardiography it was demonstrated that the selected compound-leader prevents the myocardial remodeling development in the acute phase of experimental myocardial infarction, at least not inferior to the reference inhibitor of metalloproteinases - doxycycline.

Keywords: metallproteinases 2nd- and 9th-type, post-infarction myocardial remodeling, derivatives of the benzoylamino (phenylsulfonyl) amino-substituted cyclic aminoacids

Автор, ответственный за переписку:

Крыжановский Сергей Александрович - д.м.н., зав. лабораторией фармакологического скрининга ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», 125315, Москва, ул. Балтийская, 8; тел. +7 (495)601-21-85; e-maiL: SAK-538@yandex.ru

Введение

Известно, что в условиях острого трансмурального инфаркта миокарда в результате гибели большого количества сократительных кардиомиоцитов в ишемизированном миокарде происходит существенная структурная перестройка, приводящая к значительным изменениям размеров, геометрии и функции левого желудочка сердца. Этот патологический процесс хорошо изучен как в эксперименте [9, 13, 20], так в клинике [6, 10, 19] и носит название «ранее постинфарктное ремоделирование сердца». Полагают, что одну из ключевых ролей в этом процессе играют матриксные металлопротеиназы (ММП) — энзимы, вовлекающие межклеточный матрикс миокарда в процесс структурно-функционального ремоделирования посредством деградации цепей коллагена [7, 18]. В этом плане наибольший интерес представляют цинк-зависимые матриксные металлопротеиназы 2-го и 9-го типов (желатиназы) — ММП-2 и ММП-9, поскольку известно, что, с одной стороны, они имеют тропность к коллагену I и III типа, составляющему основу межклеточного матрикса миокарда, а с другой стороны, показано, что находящийся в очаге ишемии коллаген подвергается конформационным изменениям, в результате чего его трёхмерная спираль начинает «раскручиваться», и он переходит в одномерную фрагментированную цепочку, представляющую собой желатин, который и является акцептором действия ММП-2 и ММП-9 [1, 17]. Не менее важно и то, что эти ММП, помимо внеклеточной, имеют и внутриклеточную локализацию, в том числе на мембранах саркоплазмотического ретикулума и митохондрий, а также в ядре клетки [11, 14, 16]. Недавно выполненные исследования свидетельствуют о том, что эти ферменты имеют внутри клеток специализированные протеолитические цепи и в условиях ишемии под влиянием оксидативного стресса активируются в течение нескольких секунд от момента её начала [12], что даёт основание полагать, что они (ММП) играют важную роль в развитии раннего этапа сократительной дисфункции повреждённых ишемией кардиомиоцитов [3].

В последние годы проводятся достаточно интенсивные исследования по поиску и внедрению в широкую клиническую практику лекарственных средств, селективно блокирующих гиперактивность ММП-2 и ММП-9 в ишемизированном миокарде [5], однако эта проблема все ещё далека от своего окончательного разрешения.

Цель исследования

Целью работы является поиск оригинальных биологически активных соединений, потенциально обладающих способностью блокировать активность ММП-2 и ММП-9, в ряду новых представителей бензоиламино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот общей формулы (рис. 1), поскольку эти соединения отвечают всем основным требованиям фармакофорной модели строения ингибиторов ММП-2 и ММП-9.

Материалы и методы

Животные

Все включённые в исследование животные были получены из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая». Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при контролируемом освещении (12 ч — свет/12 ч — темнота) и постоянной температуре (21—23 °C) со свободным доступом к воде и брикетированному корму в течение 10 сут до начала тестирования. Условия содержания животных соответствовало приказу МЗ РФ № 708н «Об учреждении правил лабораторной практики» от 23.08.2010 г. и этическим нормам, изложенным в Правилах лабораторной практики (GLP) Хельсинкской декларации (2 000).

Изучение влияния изучаемых соединений на уровень металлопротеиназы-9 в плазме крови крыс с острым инфарктом миокарда

Опыты проводили на беспородных крысах-самцах массой 200 -220 г. Животные были рандомизированы на 10 групп по 6 особей в каждой: 1-я — интактная, 2-я — контрольная — инфаркт миокарда, 3-я — инфаркт миокарда + эталонный препарат доксициклин, 4-10-я — группы, получавшие исследуемые соединения, соответственно, 1а, 1в, 1ж, 1з, 11а, 11в. Анестезированных (уретан 1 300 мг/кг, в/б) животных интубировали и переводили на искусственное дыхание. После торако- и перикардотомии идентифицировали левую коронарную артерии и производили её одномоментную перевязку на уровне выхода сосуда из-под ушка сердца. Эталонный препарат доксициклин (40 мг/кг/сут) и исследуемые соединения в дозе 30 мг/кг/сут вводили внутрижелудочно через зонд в 0,5 мл физиологического раствора в течение 3 дней, предшествующих эксперименту. Через 3 ч после перевязки коронарной артерии животных забивали, а кровь забирали для иммуноферментного определения уровня в плазме ММП-9. Определение уровня МПП-9 проводили с помощью автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора «Chem Well 2910 Combi», США. В работе использовали набор для иммуноферментного определения ММР-9 крысы RMP900 (R&D Systems, США). Статистическую обработку результатов проводили следующим образом: нормальность распределения выборок проверяли с помощью критерия Шапиро Уилка, гомогенность дисперсий — критерия Левена. Так как выборки имели нормальное и близкое к нему распределение и дисперсии были гомогенны, для определения статистической значимости различий использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующей обработкой с помощью метода множественных сравнений по Ньюмену Кейлсу. Результаты выражали в виде средних арифметических и их стандартных ошибок.

Изучение влияния соединения — лидера на ремоделирование миокарда в острейшую фазу экспериментального инфаркта миокарда

Опыты проводили на беспородных крысах-самцах массой 450-500 г, наркотизированных уретаном (1 300 мг/кг, в/б). Животных рандомизировали на четыре группы: 1-я — ложнооперированные (n=6); 2-я — контроль = острый инфаркт миокарда (n=12); 3-я — доксициклин + острый инфаркт миокарда (n=9); 4-я — соединение-лидер (Iа) + острый инфаркт миокарда (n=6). Экспериментальный инфаркт миокарда воспроизводили по методу Селье. После торако- и перикардотомии под переднюю ветвь левой коронарной артерии на 0,5—1 мм ниже её выхода из-под ушка сердца проводили лигатуру. У ложнооперированных животных лигатура оставалась под коронарной артерией на протяжении всего эксперимента, а у животных 2-й, 3-й и 4-й групп производили одномоментную перевязку коронарной артерии. Величину ремоделирования миокарда в 1-й и 2-й группах и влияние на неё изучаемых соединений оценивали при помощи эхокардиографии, как было описано ранее [2]. Животным 3-й группы внутрижелудочно через зонд вводили доксициклин (40 мг/кг/сут в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 3 дней, предшествующих эксперименту. Животным 4-й группы по аналогичной схеме и в том же объёме растворителя вводили соединение-лидер (30 мг/кг/сут). Животные 1-й и 2-й групп по аналогичной схеме получали 0,5 мл физиологического раствора. Статистическую обработку данных производили следующим образом: нормальность распределения выборок определяли с помощью критерия Шапиро Уилка. Так как выборки имели нормальное распределение, для определения статистической значимости изменений использовали однофакторный дисперсионный анализ и дисперсионный анализ повторных измерений с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Ньюмену Кейлсу. Различия считали значимыми при p≤0,05. Данные в таблице представлены в виде средних арифметических и их стандартных ошибок, а в тексте и фигурах — только в виде средних арифметических.

Результаты и обсуждение

Анализ результатов изучения влияния бензоила-мино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот на уровень ММП-9 в крови в условиях ишемии миокарда свидетельствует о том, что только соединение 1а значимо (р=0,022) по сравнению с контролем понижает этот показатель (рис. 2) и по своей активности, как минимум, не уступает эталонному препарату доксициклину. Выбор доксициклина в качестве эталонного препарата основан на том, что тетрациклины, в частности доксициклин, помимо собственно антибактериальной активности, обладают рядом плейотропных эффектов, в том числе и способностью блокировать гиперпродукцию ММП-2 и ММП-9 в ишемизированном миокарде и тем самым препятствовать раннему постинфарктному ремоделированию миокарда [4, 8]. Не менее важно и то, что доксициклин является первым лекарственным средством, обладающим свойствами ингибитора ММП, которое было разрешено FDA к применению в клинике по этим показаниям [15].

В следующей серии экспериментов оценивали способность соединения-лидера (1а) препятствовать ремоделированию миокарда в острейшую фазу экспериментального инфаркта миокарда. Показано, что одномоментная перевязка коронарной артерии в контрольной группе животных повлекла за собой выраженные изменения систолической функции левого желудочка. На третьей минуте после окклюзии коронарного сосуда конечно-систолический размер (КСР) левого желудочка увеличился с 1,98 до 3,11 мм; фракция выброса (ФВ) уменьшилась с 88,40 до 67,00%. Фракция укорочения (ФУ) снизилась с 53,17 до 32,27%. Этот процесс динамически нарастает во времени и достигает своего максимума в период с 10-й по 20-ю минуту после перевязки. Так, например, к 20-й минуте КСР увеличился с 1,98 до 3,84 мм, а ФВ уменьшилась с 88,4 до 58,0%. В период с 30-й по 60-ю минуту от момента перевязки коронарной артерии отмечено постепенное относительное улучшение показателей, характеризующих систолическую функцию левого желудочка, однако все они статистически значимо отличались от исходного уровня (табл. 1).

В группе животных (n=9), получавших доксициклин (40 мг/кг, per os), одномоментная перевязка коронарной артерии также влекла за собой снижение систолической функции левого желудочка сердца, однако в первые 20 мин от момента начала ишемии интенсивность этого процесса была статистически значимо ниже (табл. 1, рис. 3, 4). Так, например, к 20-й минуте ишемии у контрольных животных КСР увеличивался с 1,98 до 3,84 мм, т. е. практически в 2 раза, тогда как у животных, получавших доксициклин, увеличение КСР составило менее 60% (соответственно, с 1,77 до 2,80 мм) — различия статистически значимы (p=0,004) (табл. 1, рис. 3). К этому моменту у контрольных животных ФВ снизилась с 88,4 до 58,0%, т. е. на 34%, а у животных, получавших доксициклин — менее чем на 25% (соответственно, с 91,4 до 69,5%) — различия статистически значимы (р=0,002) (табл. 1, рис. 4). Начиная с 30-й минуты ишемии, показатели, характеризующие систолическую функцию левого желудочка сердца, в группе животных, получавших доксициклин, статистически значимо не отличались от таковых, зарегистрированных в это же время в контрольной группе.

В группе животных (n=6), получавших соединение 1а (30 мг/кг, per os), одномоментная перевязка коронарной артерии, так же как в контроле и в группе животных, получавших доксициклин, влекла за собой снижение систолической функции левого желудочка сердца, однако в первые 20 минут от момента начала ишемии интенсивность этого процесса была статистически значимо ниже, чем в контроле (табл. 1, рис. 2-3). Так, например, к 20-й минуте ишемии у контрольных животных КСР увеличивался с 1,98 до 3,84 мм, т. е. практически в 2 раза, тогда как у животных, получавших соединение 1а, увеличение КСР составило, так же, как и в случае доксициклина, менее 60% (соответственно, с 1,84 до 2,87 мм), различия статистически значимы (p=0,007) (табл. 1, рис. 2). К этому моменту у контрольных животных ФВ снизилась с 88,4 до 58,0%, т. е. на 34%, а у животных, получавших соединение 1а — менее чем на 25% (соответственно, с 90,5 до 68,9%) — различия статистически значимы (р=0,001) (табл. 1, рис. 3). Если различия в показателях, отражающих систолическую функцию сердца в период максимального падения сократимости миокарда (10-20-я минуты ишемии) между контрольной группой и группой животных, получавших соединение 1а, статистически значимы, то различия в величине КСР и ФВ между группами, получавшими доксициклин и соединение 1а, практически отсутствуют: соответственно р=0,840 и р=0,587.

Таким образом, в ряду бензоиламино(фенил- сульфонил)-замещённых циклических аминокислот выявлено соединение — лидер: 1-({4-[(4-хлорбензо- ил)амино]фенил}сульфонил-L-пролин, — которое по своей способности как препятствовать раннему постинфарктному ремоделированию миокарда, так и подавлять экспрессию ММП-9, как минимум, не уступает эталонному ингибитору металлопротеиназ доксициклину. Полученные данные составляют основу для дальнейшего фармакологического изучения соединения-лидера.

Литература

1.           Гасанов А.Г., Бершова Т.В. Роль изменений внеклеточного матрикса при возникновении сердечно-сосудистых заболеваний. Биомед. химия. 2009; 55: 2: 155-168.

2.           Крыжановский С.А., Колик Л.Г., Цорин И.Б., Ионова Е.О., Сто- лярук В.Н., Сорокина А.В., Вититнова М.Б., Мирошкина И.А. Доказательство валидности эхокардиографии в модельных экспериментах на мелких животных. Бюл. эксп. биол. и медицины. 2016; 161: 3: 416—420.

3.           Ali M.A., Fan X., Schulz R. Cardiac sarcomeric proteins: novel intracellular targets of matrix metalloproteinase-2 in heart disease. Trends Cardiovasc. Med. 2011; 21: 4: 112—118.

4.           Bench T.J., JeremiasA., Brown D.L. Matrix metalloproteinase inhibiton with tetracyclines for the treatment of coronary artery disease. Pharmacol. Res. 2011; 64: 561—566. 

5.           BencsikP., PalocziJ., KocsisG.F., Pipis J., BeleczI., Varga Z.V., Csonka C., Gorbe A., Csont T., Ferdinandy P. Moderate inhibition of myocardial matrix metalloproteinase-2 by ilomastat is cardioprotective. Pharmacol. Res. 2014; 80: 36-42.

6.           Chang S.A., ChangH.J., Choi S.I., Chun EJ, Yoon Y.E., Kim H.K., Kim Y.J., Choi D.J., Sohn D. W., Helm R.H., Lardo A.C. Usefulness of left ventricular dyssynchrony after acute myocardial infarction, assessed by a tagging magnetic resonance image derived metric, as a determinant of ventricular remodeling. Am.J. Cardiol. 2009; 104: 1: 19-23.

7.           Gallagher G.L., Jackson C.J., Hunyor S.N. Myocardial extracellular matrix remodeling in ischemic heart failure. Front. Biosci. 2007; 12: 1410-1419.

8.           Griffin M.O., Fricovsky E., Ceballos G., Villarreal F. Tetracyclines: a pleotropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. Am.J. Physiol. Cell. Physiol. 2010; 299: 539-548.

9.           Henderson K.K., Danzi S., Paul J. T., Leya G., Klein I., Sama- rel A.M. Physiological replacement of T3 improves left ventricular function in an animal model of myocardial infarction-induced congestive heart failure. Circ. Heart Fail. 2009; 2: 3: 243-252.

10.         HoriM., NishidaK. Oxidative stress and left ventricular remodelling after myocardial infarction. Cardiovasc. Res. 2009; 81: 3: 457-464.

11.         Hughes B.G., Fan X., Cho W.J., Schulz R. MMP-2 is localized to the mitochondria-associated membrane of the heart. Am.J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2014; 306: 5: H764-H770.

12.         Hughes B.G., Schulz R. Targeting MMP-2 to treat ischemic heart injury. Basic Res Cardiol 2014; 109(4):424.

13.         Jugdutt B. J. The dog model of left ventricular remodeling after myocardial infarction. Card. Fail. 2002; 8: 6 Suppl: S472-S475.

14.         Kandasamy A.D., Chow A.K., Ali M. A., Schulz R. Matrix metalloproteinase-2 and myocardial oxidative stress injury: beyond the matrix. Cardiovasc. Res. 2010; 85: 3: 413-423.

15.         Lindsey M.L. Matrix Metalloproteinase-9 Post Myocardial Infarction: Breakdowns and Breakthroughs. Global J. Hum. Anat. Physiol. Res. 2014; 1: 6-9.

16.         MoshalK.S., Rodriguez W.E., Sen U., TyagiS.C. Targeted deletion of MMP-9 attenuates myocardial contractile dysfunction in heart failure. // Physiol. Res. - 2008. - Vol. 57, № 3. - P. 379-384.

17.         Shamhart P.E., Meszaros J.G. Non-fibrillar collagens: key mediators of post-infarction cardiac remodeling? J. Mol. Cell. Cardiol. 2010; 48: 3: 530-537.

18.         Spinale F. G. Myocardial matrix remodeling and the matrix metalloproteinases: Influence on cardiac form and function. Physiol. Rev. 2007; 87: 1285-1342.

19.         Tiyyagura S.R., Pinney S.P. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: past, present, and future. Mt. Sinai J. Med. 2006; 73: 6: 840-851.

20.         Zhou S.X., Zhou Y., Lei J., Zhang Y.L. Effects of oxidative stress on ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2008; 28: 11: 2030-2034.

 

Похожие статьи