Статистический анализ данных исследований биоэквивалентности лекарственных средств
Пн, 14 Янв 2013
5248

Возрастающий интерес к проблеме биоэквивалентности в последнее время объясняется появлением большого количества генерических лекарственных препаратов. Объектами исследования биоэквивалентности являются генерические препараты, предназначенные для внесосудистого введения, если их действие опосредовано появлением лекарственного средства в системном кровотоке. Биоэквивалентность является достаточно емким и многогранным понятием. Для установления биоэквивалентности (фармакокинетической эквивалентности) генерических и оригинальных препаратов выполняется специальное фармакокинетическое исследование, позволяющее сравнить относительную биодоступность лекарственного вещества при введении в одинаковых дозах при одинаковых условиях. Относительная биодоступность характеризуется степенью (относительным количеством препарата, достигающим системного кровотока) и скоростью процесса всасывания. Несмотря на кажущуюся простоту такого определения биоэквивалентности, достаточно сложной задачей оказалось найти точный способ практической оценки и сравнения скоростей всасывания лекарственного препарата. До сих пор нет единого мнения, какие показатели должны быть рассмотрены для установления биоэквивалентности, а также какие статистические процедуры лучше применять для анализа данных. Большинство этих вопросов рассмотрено в работах [2, 10, 13, 25, 35, 37, 39]. Проведение исследований биоэквивалентности и статистический анализ результатов таких исследований регламентируется специально разработанными правилами [1, 20]. В этой работе мы попытаемся проанализировать методические рекомендации к проведению статистического анализа исследований биоэквивалентности, разработанные и действующие в настоящее время в США и в нашей стране.

Статистические процедуры для оценки биоэквивалентности. Обычно клинические исследования, целью которых является установление биоэквивалентности, проводятся в соответствии с двойным слепым AВ/ВA перекрестным дизайном. В качестве стандарта для сравнения обычно берется известный зарегистрированный препарат, а в качестве тестового ‑ изучаемый препарат со сходными свойствами.

Стандартная процедура представляет собой измерение уровней концентрации сравниваемых препаратов и метаболитов в крови (иногда и в моче) после получения однократной дозы или при повторяющемся дозировании для каждого субъекта, включенного в исследование. Периоды измерения уровня концентрации для различных препаратов у одного и того же субъекта разделяются достаточно продолжительным временным интервалом (5-6 периодов полувыведения препарата), необходимым для исключения взаимовлияния препаратов. Измерения концентраций при однократном приеме препарата производятся в течение по меньшей мере трех - четырех периодов полувыведения препарата или прекращаются после снижения концентрации ниже пределов регистрации.

Согласно принятым в настоящее время правилам, биоэквивалентность проверяется с помощью немодельного метода. Правила регламентируют выбор основных показателей эквивалентности, которые оцениваются непосредственно по зарегистрированным кривым «концентрация – время». Минимальный набор основных параметров сравнения при однократном приеме препаратов включает средние значения (или медианы) следующих фармакокинетических показателей [20]:

  • площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время» от нулевого момента времени до времени T последнего измерения, вычисленная методом трапеций;
  • площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время от нулевого момента времени до бесконечности, , где  - значение последней измеренной концентрации, l - константа скорости элиминации препарата, вычисленная подходящим методом (например, методом наименьших квадратов по последним измерениям концентрации, соответствующих нисходящей фазе ФК профиля);
  • значение максимальной концентрации Cmax и значение времени достижения максимальной концентрации Tmax, оцененные без интерполяции по зарегистрированным кривым;
  • значение среднего времени удержания препарата в организме - MRT.

Основным показателем биоэквивалентности считается так называемое отношение биодоступности ‑ отношение площадей под фармакокинетическими кривыми для тестового препарата и стандарта. Это отношение является оценкой относительной степени всасывания. Параметры Cmax и Tmax, несмотря на многочисленные научные споры, используются для сравнения скорости всасывания. Хотя минимальный набор и не включает показатель Cmax/AUC, он также часто включается для оценки скорости всасывания [7, 29, 30].

В случае многократного дозирования и исследования биоэквивалентности при стационарном распределении препарата в организме рекомендуемый минимальный набор показателей включает [20]:

  • площадь под фармакокинетической кривой «концентрация‑время» от нулевого момента времени до конца интервала дозирования t, вычисленная после установления стационарного распределения;
  • значение максимальной концентрации Cmax и значение времени достижения максимальной концентрации Tmax, оцененные без интерполяции по зарегистрированным кривым после приема последней дозы препарата;
  • Cmin – концентрация препарата в конце каждого интервала дозирования после установления стационарного распределения препарата;
  • Cav – средняя концентрация в интервале дозирования после установления стационарного распределения препарата, ;
  • DF - флуктуации препарата после установления стационарного распределения, .

Необходимость изучения биоэквивалентности в стационарном состоянии должна быть обоснована в протоколе исследования.

До начала 80-х гг. наиболее распространенным статистическим тестом для проверки биоэквивалентности и сравнения средних значений выбранных показателей был дисперсионный анализ (ANOVA) [14, 18, 32]. В рамках этого метода выдвигалась стандартная нулевая гипотеза Ho об отсутствии различий между сравниваемыми препаратами (или, другими словами, между выбранными показателями биоэквивалентности). Аддитивная модель, подразумевающая аддитивность вкладов различных составляющих, предполагает, что изучаемый эффект может быть представлен в виде суммы [25]:

,

т.е. Xijk - индивидуальное наблюдение переменной эффекта у j - субъекта после получения i-препарата в k последовательности (k = 1,2; j =1,…n/2; i = 1 и 2) представляет собой сумму:

·       общего среднего m,

·       параметра sjk, отражающего специфическую для данного j-субъекта реакцию,

·       параметра ti, отражающего эффект от приема именно i – препарата,

·       параметра pl, характеризующего вклад, связанный с l-периодом измерений (l = 1,2),

·       eijk - случайной ошибки модели. Предполагается, что ошибка eijk имеет нормальное распределение с нулевым математическим ожиданием и дисперсией De.

В рамках такой модели среднее значение параметра эффекта для i-препарата может быть выражено как , ошибка  имеет нормальное распределение с нулевым средним и дисперсией, равной De/n.

Кроме того, основными предположениями, лежащими в основе математической модели данных для метода анализа вариаций в исследованиях биоэквивалентности, являются нормальное распределение данных, рандомизация пациентов, близость значений дисперсии показателей для сравниваемых препаратов.

С помощью F-теста на определенном уровне значимости с учетом числа степеней свободы может быть проверена гипотеза о несущественном вкладе различий между препаратами в общую вариацию данных. Однако такой подход имеет ряд недостатков. Один из них связан с ключевым предположением, на котором основан данный подход. Последний может применяться только в предположении о полном отсутствии взаимовлияния рассматриваемых препаратов в интервалах времени проведения соответствующих измерений. В случае, если период времени между приемом различных препаратов оказался недостаточным для полного исключения такого эффекта, данное предположение нарушается и результаты оказываются неверными. Если отказаться от этого предположения, необходимые математические модификации модели оказываются слишком сложными [26, 37]. Другая проблема обусловлена связью числа испытуемых, устанавливаемой величиной различий и мощности теста. При достаточно большом объеме выборки можно статистически доказать наличие даже очень незначительных, с клинической точки зрения, различий. С другой стороны, наоборот, слишком маленький объем выборки может не позволить установить даже существенные различия. Попыткой регулировать последнее ограничение можно считать разработку так называемого «80/20» правила [15, 26, 35]. Оно означает, что исследование биоэквивалентности должно быть спланировано и проведено так, чтобы мощность статистического теста для выявления 20% статистически значимого различия между препаратами была не меньше 80%.

В случае сравнения двух препаратов F- тест для анализа вариаций эквивалентен проверке традиционной нулевой гипотезы об отсутствии различий между средними значениями параметров биоэквивалентности  и  (  и - их выборочные оценки, полученные на основе имеющихся данных) с помощью двустороннего критерия Стьюдента (обычно на уровне значимости 5%). Значение тестовой статистики в этом случае равно , где n - число субъектов, включенных в исследование, s - среднее квадратичное отклонение, оцененное с помощью анализа вариации для перекрестного дизайна (обычно оценка значения s - квадратный корень из среднего квадрата «ошибки», или остаточной внутрииндивидуальной вариацией MSE). Вычисленное значение статистики сравнивается с табличным для двустороннего критерия на выбранном уровне значимости. Однако данный тест, как и дисперсионный анализ, устанавливает лишь наличие или отсутствие различий. Таким образом, независимо от мощности теста этот тест по своей сути является средством для проверки гипотезы о точном совпадении средних значений (и соответствующих препаратов), он не позволяет адекватно проверять гипотезу о «приблизительной эквивалентности». Поэтому в настоящее время такой подход применяется не для принятия окончательного решения о биоэквивалентности, а для проверки гипотез о статистической значимости влиянии различных факторов: различий между препаратами (терапия), межиндивидуальных различий (субъекты), последовательности приема препаратов и периодов исследования на наблюдаемую вариацию данных. Кроме того, полученная с помощью метода ANOVA оценка остаточной вариации (MSE) используется при планировании необходимого числа включаемых в исследование пациентов и расчета соответствующего доверительного интервала.

Анализ вариаций и критерий Стьюдента являются параметрическими методами и предполагают нормальное распределение данных. Если распределение данных отличается от нормального или нарушаются любые другие приведенные выше предположения, лежащие в основе метода ANOVA, можно попробовать применить преобразование, приводящее к нормальному распределению, или использовать подходящие непараметрические процедуры сравнения. В случае исследований биоэквивалентности обычно применяют преобразование типа «взятие логарифма» (натурального ln или десятичного lg). Многие биологические признаки не могут принимать отрицательные значения и имеют несимметричное распределение, что свидетельствует в пользу их лог-нормального распределения. Но, что самое главное, результаты, полученные после такого преобразования, могут быть интерпретированы как геометрические средние. В исследованиях биоэквивалентности отношения средних показателей часто представляют больший интерес, чем различия между ними. Использование логарифмического преобразования позволяет перейти от различий между средними значениями преобразованных данных в соответствии с аддитивной моделью (для которой применимы хорошо разработанные статистические процедуры) к отношению соответствующих средних значений (или медиан) исходных данных. Если предполагается лог-нормальное распределение соответствующего параметра, сравнение его преобразованных средних значений с помощью дисперсионного анализа проводится на основе мультипликативной модели данных. Приведем общий вид такой модели для проверки биоэквивалентности препаратов [25]:

где Xijk - индивидуальное наблюдение переменной эффекта у j - субъекта после получения i-препарата в k последовательности (k=1,2; j=1,…n/2; i=1 и 2) представляет собой произведение:

·       общего среднего m,

·       параметра sjk, отражающего случайный эффект, специфический для данного j-субъекта при получении терапии в k-последовательности,

·       параметра ti, отражающего прямой эффект от приема именно i – препарата,

·       параметра pl, характеризующего влияние l-периода измерений (l=1,2),

·       eijk - случайной ошибки модели.

ln sjk имеет нормальное распределение с нулевым математическим ожиданием и Ds, а ln eijk - нормальное распределение с нулевым математическим ожиданием и De.

Взятие логарифма от обеих частей модели приводит к соотношению:

.

Не вдаваясь в математические подробности, приведем сразу конечный результат, имеющий прикладное значение: разность средних значений  и  трансформированных переменных (при логарифмическом преобразовании данных) для сравниваемых препаратов, является несмещенной оценкой логарифма отношений средних значений исходных переменных  и , который в свою очередь оценивает логарифм отношения соответствующих прямых эффектов от сравниваемых препаратов t2 и t1:

Тогда легко выводится соотношение, связывающее коэффициент вариации для значений Xijk (CVx) с остаточной вариацией для Yijk, предоставляемой, например дисперсионным анализом после логарифмического преобразования данных:

Если значение  мало,  А значит, стандартное отклонение трансформированных данных приблизительно равно коэффициенту вариации исходных данных. Последнее соотношение часто применяется для расчета таблиц необходимого числа испытуемых для исследований биоэквивалентности [5,6,17,25]. Надо иметь в виду, что коэффициент вариации исходных данных также относится в данном случае не к полной, а скорее к остаточной вариации данных.

Важность проведения расчетов необходимого числа включенных пациентов подчеркивается в правилах проведения исследований. Обычно эти оценки проводятся отдельно для выбранных показателей эквивалентности [37].

Объяснение применению логарифмического преобразования данных можно найти и с фармакокинетической точки зрения. Известное общее соотношение для основного показателя биоэквивалентности может быть записано в рамках линейной кинетики при условии, что выведение препарата происходит только из центральной камеры:

,

F×D – фракция дозы, достигшая кровотока, CL - клиренс препарата у данного субъекта, V – кажущийся обьем распределения,  - константа скорости элиминации.

Таким образом, использование показателя AUC в качестве меры количества препарата, достигшего кровотока, (степень всасывания) предполагает включение в модель мультипликативного члена CL (произведение V и ), который может рассматриваться как функция конкретного субъекта. А значит, межиндивидуальные различия не могут адекватно рассматриваться в рамках аддитивной модели исходных данных. Проведение логарифмического преобразования приводит к аддитивной модели:

.

Похожие аргументы справедливы и для показателя Cmax. В рамках однокамерной модели можно записать следующее уравнение для этого показателя биоэквивалентности:

,

где опять параметры F, D и V представлены в виде мультипликативного члена. После логарифмического преобразования последнее уравнение будет иметь вид, соответствующий аддитивной модели:

.

Надо иметь в виду, что для проведения формальной проверки соответствия распределения определенного показателя нормальному или лог-нормальному закону в случае исследования биоэквивалентности обычно не хватает данных (при n=20, 30). Поэтому, если не возникает явного противоречия с данными, анализ проводят в предположении о лог-нормальном распределении параметра AUC и Cmax. Отказ от проведения логарифмического преобразования для этих показателей эффекта должен быть обоснован в протоколе исследования. Вообще, в соответствии с правилами, протокол исследования должен отражать предположения о форме распределения выбранных показателей эквивалентности, а также включать их индивидуальные значения, попарные индивидуальные различия (или отношения), средние значения (арифметические и геометрические), средние значения различий (или отношений), соответствующие стандартные отклонения и коэффициенты вариации. Желательно также представлять гистограммы распределения различий и логарифмических отношений основных показателей биоэквивалентности (AUC, Cmax) [20].

Согласно правилам, статистическая проверка биоэквивалентности состоит в статистическом сравнении средних значений параметров, выбранных в качестве показателей биоэквивалентности (например, AUC и Cmax), с помощью интервального критерия. Если два таких средних значения оказываются «достаточно близкими» (не обязательно равными), препараты считаются биоэквивалентными. Пусть  и  – генеральные средние показатели биоэквивалентности для тестового и стандартного препаратов. Гипотеза о биоэквивалентности может быть сформулирована в терминах отношения сравниваемых параметров или в терминах их абсолютных различий. Для параметров AUC и Cmax обычно принято сравнение отношений. Если  и  - нижняя и верхняя принятые допустимые границы биоэквивалентности, нулевая гипотеза об отсутствии эквивалентности может быть записана как:

Ho :  или ,

а соответствующая альтернативная гипотеза о наличии биоэквивалентности формулируется как:

 : .

В случае проведения логарифмического преобразования формулировка гипотез также трансформируется:

 : ,

где , при i=1,2; в этом случае  – разность средних значения показателей биоэквивалентности, соответствующая логарифмической трансформации. Такой же вид гипотезы соответствует тестированию абсолютных различий.

Для отношений биоэквивалентности были выбраны допустимые пределы. Если рассматривается абсолютная арифметическая разница между средними, соответствующими допустимыми пределами различий считаются 20% от значения параметра  (0,8 – 1,2). Эти пределы, однако, не являются инвариантными к обратному преобразованию, поскольку величина, обратная 0,8, равна 1,25. А это значит, что, несмотря на кажущуюся симметрию этих пределов, вывод об эквивалентности двух препаратов зависит от того, какой препарат считается тестовым, а какой стандартным. Кроме того, часто анализируются не сами AUC, а их натуральные логарифмы lnAUC. Тогда значениям пределов 0,8 – 1,2 будут соответствовать также несимметричные пределы –0,223 и 0,183. Поэтому в настоящее время приняты значения пределов 0,8 – 1,25 для отношений показателей [20].

Процедура тестирования интервальных гипотез типа  или  производится с помощью их декомпозиции и проверки двух соответствующих односторонних тестов для выбранных пределов эквивалентности  и :

 :                 :

 и

 :                : .

Вывод об эквивалентности в результате тестирования гипотез может быть сделан, если на одном и том же уровне значимости удается отвергнуть обе нулевые гипотезы  и , а значит, и общую интервальную гипотезу Ho, Каждая составляющая данной гипотезы проверяется по стандартной процедуре тестирования простой односторонней гипотезы на одном и том же выбранном уровне значимости a. Например, в случае нормального распределения, по критерию Стьюдента рассчитываются тестовые статистики вида [31]:

              и         

где  - средний квадрат «ошибки» MSE, предоставляемый анализом вариации . Рассчитанные значения статистик сравниваются с табличным для одностороннего теста и уровня значимости обычно равного 5%.

В исследованиях биоэквивалентности процедура проверки двух таких односторонних гипотез приводит к установлению биоэквивалентности в том случае, если 100*(1-2*a)% доверительный интервал для различий (или отношений) полностью располагается внутри выбранного интервала эквивалентности. Поэтому в настоящее время для проверки биоэквивалентности обычно вычисляются 90% доверительные интервалы и проверяется, находятся ли они внутри выбранных пределов эквивалентности. Это соответствует проверке двух односторонних тестов на уровне значимости 5%. В настоящее время принято к индивидуальным вычисленным показателям AUCij применять логарифмическое преобразование и весь последующий анализ проводить для этих трансформированных величин. Вычисленные границы 90% доверительного интервала для выборочной средней разности lnAUC подвергаются преобразованию, обратному взятию натурального логарифма (exp{lnAUC}), полученные значения сравниваются с пределами эквивалентности (0,8; 1,25). Избежать обратного преобразования можно, сравнив полученные значения для границ доверительного интервала с пределами эквивалентности по логарифмической шкале (-0,223; 0,223). Логарифмическое преобразование применяется и для переменной Cmax. В общем случае для отношений Cmax устанавливаются те же допустимые пределы эквивалентности, что и для переменной AUC.

Значения пределов биоэквивалентности обсуждаются и в настоящее время. Так, для отношений Cmax были предложены границы (0,7; 1,43) [6, 26]. Аргументом в пользу такого расширения допустимых пределов для отношений Cmax было замечание, что такой экстремальный параметр, как Cmax, основанный на единственном измерении, имеет большую вариацию, чем интегральный показатель AUC. Есть предложение также установить для препаратов с узким терапевтическим коридором более жесткие допустимые границы, скажем (0,9; 1,11) для AUC и (0,8; 1,25) для Cmax [6]. В любом случае выбор допустимых пределов биоэквивалентности должен быть основан не только на статистических, но и на клинических данных и соображениях, аналогично выбору «клинически значимого различия». При этом авторы [26] не исключают, что для некоторых антибиотиков такие границы могут быть даже односторонние, например (0,8; ¥).

Известно несколько способов построения доверительных интервалов для разности или отношения показателей биоэквивалентности: на основе парного критерия Стьюдента; на основе остаточной вариации, предоставляемой дисперсионным анализом ANOVA для перекрестного дизайна AB/BA; симметричные интервалы, предложенные Westlake; специальные непараметрические процедуры [26, 31, 36, 37, 39, 40].

В случае построения 90%-ного доверительного интервала для разницы средних значений ( ) с помощью дисперсионного анализа ANOVA для сбалансированного (число пациентов в обеих подгруппах A и B одинаково и равно n/2) перекрестного дизайна AB/BA границы могут быть вычислены по формуле:

 

,

где n – общее число включенных в исследование субъектов, MSE - средний квадрат ошибки, оцененный с помощью метода ANOVA, t(n-2;0,9) – коэффициент Стьюдента (определяется по соответствующим таблицам) для числа степеней свободы n-2 и двустороннего 10% уровня.

Тогда 90%-ный доверительного интервала для отношений средних значений ( ) с помощью дисперсионного анализа ANOVA для сбалансированного перекрестного дизайна AB/BA строится по формуле:

.

Если в выбранной математической модели данных постулируется отсутствие эффекта периода наблюдения, и исследование биоэквивалентности проводится в соответствии с обычным перекрестным дизайном, предыдущие формулы несколько изменяются:

,

,

где Sd – стандартное отклонение попарных различий. Таким образом, в данном случае доверительные интервалы базируются на парном критерии Стьюдента.

В случае незначительного влияния периода наблюдения первые два метода будут давать практически совпадающие интервалы. Метод, предложенный Westlake [39, 40], предоставляет доверительный интервал, симметричный относительно точки отсутствия различий. Далее нами будет приведена одна из непараметрических процедур.

Рассмотренные до сих пор статистические методы проверки биоэквивалентности были параметрическими, то есть предполагали нормальное или лог-нормальное распределение сравниваемых параметров. Для решения этой задачи применяются и непараметрические методы. Так, поскольку такая переменная, как Tmax, по своей природе не может иметь нормальное или лог-нормальное распределение, рекомендуется применять непараметрические методы анализа. Однако для небольшого объема выборок, часто используемых в таких исследованиях (20, 30 испытуемых), традиционные непараметрические методы являются недостаточно эффективными. Обзор непараметрических методов, применяемых в таких исследованиях, приведен в работах [26, 35].

Остановимся подробнее на одном из таких свободных от предположений о распределении методов, используемых при проверке биоэквивалентности. Он представляет собой некоторое обобщение теста знаковых рангов Уилкоксона [36, 37]. Как было сказано выше, для проверки биоэквивалентности строятся доверительные интервалы для отношений биодоступности AUC(test)/AUC(standard) в предположении конкретной формы их распределения. Метод Уилкоксона позволяет построить такие интервалы без учета формы распределения и, кроме того, позволяет построить распределение вероятностей для таких значений отношений биодоступности. Для данной процедуры предполагается, что в результате исследования, выполненного в соответствии с перекрестным планом, было получено n индивидуальных значений отношений биодоступности ri= AUCi(test)/AUCi(standard) (i = 1,2,…n). Для всех полученных значений ri вычисляются значения геометрических средних  (для всех значений i меньше или равных j, j = 1,2,…n), всего n(n+1)/2 значений gij. Полученные значения геометрических средних ранжируются от меньшего к большему. Не вдаваясь в математические подробности (они детально изложены в работе [46]), можно сказать, что для наиболее распространенного случая n=12 искомые границы 95%-ного доверительного интервала задаются 14-ым (нижняя граница) и 65-ым (верхняя граница) значениями ранжированных геометрических средних (для n=24 между 82 и 219 средним). Поскольку при наличии биоэквивалентности индивидуальные отношения AUC должны распределяться вокруг 1, а доверительные интервалы для среднего отношения не должны выходить за пределы (0,8, 1,25), построенная гистограмма распределения индивидуальных геометрических средних дает наглядное представление о соответствии имеющихся данных гипотезе о биоэквивалентности. Строго гипотезу о равенстве единице медианного элемента распределения геометрических средних проверяют с помощью критерия знаковых рангов Уилкоксона. Для этого вычисляются отдельно суммы рангов геометрических средних в ранжированном ряду, больших и меньших единичного значения. Меньшую из двух таких сумм сравнивают с соответствующим табличным значением [5, 46]. Медиана распределения в случае n=12 вычисляется как среднее значение 39-ого и 40-ого элементов. Кроме того, визуальный анализ такого распределения может позволить выявить мультимодальность распределения для некоторых лекарственных препаратов. Такое возможно в случае, если среди испытуемых выделяются субъекты, например, с высокой и низкой скоростью метаболизма одного из препаратов.

Последнее обстоятельство, в соответствии с имеющимися правилами, требует специального рассмотрения и отражения в протоколе исследования. Резко отклоняющиеся наблюдения (outliers) в исследования биоэквивалентности, обычно проводящегося по перекрестной схеме, означают, что у одного или нескольких субъектов значения различий или отношений индивидуальных показателей биодоступности существенно отличаются от значений у основной группы. Это может быть связано либо с недостатками сравниваемого препарата (например, с особенностями его растворимости), либо с наличием малочисленных подпопуляций, у которых относительная биодоступность сравниваемых препаратов значимо отличаются от остальной более многочисленной популяции. Для этой подпуляции эти препараты являются небиоэквивалентными даже, если они будут признаны биоэквивалентными в среднем. Для проверки таких резко выделяющихся наблюдений разработаны специальные статистические тесты. В случае одного выделяющегося наблюдения наиболее часто применяется тест, основанный на проверке стьюдентизированного остатка [24]. Тем не менее, резко выделяющиеся наблюдения не могут быть автоматически исключены из анализа только на основании проверки статистического теста. В случае если статистический анализ показал наличие таких наблюдений, необходимо привести в протоколе научное объяснение этого явления и доказательство справедливости исключения данных этих субъектов из последующего анализа.

Популяционная и индивидуальная биоэквивалентность. Вообще традиционный подход к оценке биоэквивалентности предполагает сравнение средних значений параметров, не изучая в явном виде интраиндивидуальную вариабельность реакций на сравниваемые препараты. Такой «усредненный» подход является частным случаем так называемой популяционной биоэквивалентности. Популяционная биоэквивалентность подразумевает получение и сравнение не только средних оценок параметров, выбранных для установления наличия или отсутствия биоэквивалентности, а построение и сравнение полного распределения таких параметров у изучаемой популяции пациентов. В этой области существует еще много вопросов, подробнее этот подход рассмотрен в [15]. Популяционный подход является важным шагом к изучению индивидуальной биоэквивалентности, поскольку предполагает оценку вариабельности параметров. Однако такой подход не позволяет прогнозировать реакцию пациента на замену одного сравниваемого препарата другим в ходе терапии, что бывает очень важно в случае препаратов с узким «терапевтическим коридором». Такой анализ возможен в рамках изучения индивидуальной биоэквивалентности [3, 9, 11, 15, 21, 22, 33, 34, 38].

По определению, предложенному авторами [15], индивидуальная биоэквивалентность предполагает, что выбранные параметры будут достаточно близкими для большинства субъектов рассматриваемой популяции. Это определение содержит два понятия, нуждающихся в уточнении: как определить, что два интраиндивидуальных параметра имеют близкие значения и каков должен быть минимальный процент пациентов с близкими значениями параметров в популяции. Существует мнение, что для изучения индивидуальной биоэквивалентности для полного исключения взаимовлияния препаратов более корректным будет исследование, основанное на перекрестном плане с четырьмя периодами измерений. Каждый испытуемый должен получить каждый препарат дважды в разной последовательности. Другая проблема состоит в том, что пока не выработано правило, регламентирующее допустимую интраиндивидуальную вариабельность. Прежде всего, это относится к количеству добровольцев, необходимых для получения корректных данных. В различных странах это количество варьируется от 12 человек в странах западной Европы до 24 человек в США. Однако, определить точное количество человек, необходимых для проведения исследования, можно лишь опираясь на данные математической статистики для межиндивидуального разброса для каждого конкретного препарата. Вопросу отбора добровольцев в мировой литературе уделяется достаточно много внимания и по нашему мнению этой задаче имеет смысл посвятить отдельную публикацию. С точки зрения математики трудно разделить истинные различия между препаратами и интраиндивидуальную вариабельность. Ведь если интраиндивидуальная вариабельность достаточно большая, скорее всего в ходе исследования препараты будут признаны не биоэквивалентными. Тогда, какой же уровень различий признать недопустимыми проявлениями интраиндивидуальной вариабельности в рамках признания препаратов биоэквивалентными в среднем? Была сделана попытка для оценки индивидуальной биоэквивалентности применять правило 75/75. В соответствии с этим правилом у 75% субъектов популяции индивидуальные отношения биодоступности (отношения AUC) должны быть в пределах от 75 до 125%.

В октябре 2000г. специально созданная Рабочая Группа при FDA опубликовала в журнале «Statistics in Medicine» предварительный проект новых правил для более строгой оценки популяционной и индивидуальной биоэквивалентности [4, 8, 12, 16, 19]. Все предлагаемые критерии в основном являются интегральными, то есть объединяют в одну формулу различия между соответствующими средними значениями параметров биоэквивалентности, различия между оценками их межиндивидуальной вариабельности и ошибки измерений (внутрииндивидуальная вариабельность). Все эти значения оцениваются с помощью популяционного подхода для 3-х или 4-х периодного мультиперекрестного дизайна и объединяются в формулах критериев (для основных показателей AUC, Cmax):

,

где Xijk – k-измерение у пациента i, после получения препарата j (j – T-test или R-reference) – независимые, распределенные со средним  и дисперсией  (внутрииндивидуальная вариабельность). Индивидуальные средние  и  имеют совместное распределение со средними  и дисперсией  (межиндивидуальная вариабельность). Корреляция обозначается как r. При анализе индивидуальной биоэквивалентности важным вопросом является оценка величины индивидуальных различий между параметрами биоэквивалентности для субъектов исследования и одинаковы ли такие различия для всех этих субъектов. Мерой таких различий в терминах взаимовлияния субьект-препарат является величина . Равенство нулю этой величины говорит о том, что индивидуальные различия равны средним различиям , из чего следует биоэквивалентность «в среднем». В случае популяционной биоэквивалентности, критерий для ее проверки упрощается, в предыдущих формулах отсутствует слагаемое . Естественно изменяются и допустимые пределы для этого критерия.

Как и раньше для рассчитанных значений критерия строятся доверительные интервалы, которые сравниваются с предложенными допустимыми значениями. Поскольку исследования биоэквивалентности проводятся на небольшом количестве испытуемых, корректировать значения несколько переоцененных доверительных интервалов предлагается с помощью статистического бутстрап - метода (bootstrap) (параметрический метод компенсации погрешностей) [41].

Предложенный подход обсуждался в печати всеми заинтересованными сторонами: учеными, представителями фармацевтических фирм, представителями организаций, регламентирующих клинические исследования, и был в последствии принят к исполнению в качестве новых Правил. Несмотря на дополнительные сложности по проведению исследований по предложенной схеме (3-х или 4-х периодный мультиперекрестный дизайн) и последующим расчетам в соответствии с предложенными статистическими процедурами (необходимо специальное программное обеспечение), данный подход кажется нам более обоснованным, чем применявшееся ранее правило 75/75. Вычисление 75% от полученных индивидуальных значений достаточно странно проводить в реальных исследованиях, обычно включающих 8-18 субъектов.

Программа BIOEQV для проведения статистического анализа данных исследования биоэквивалентности.     Разработанная Бондаревой И.Б. программа BIOEQV применялась в течение последних 5 лет для статистической обработки данных исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов, проводимых в Лаборатории клинической фармакокинетики кафедры клинической фармакологии РГМУ. Эта программа позволяет оценивать немодельным способом основные фармакокинетические показатели, выбранные для демонстрации биоэквивалентности, по результатам проведенных измерений концентрации и проводить полный статистический анализ для оценки биоэквивалентности «в среднем». Моменты фармакокинетической кривой (AUC, MRT – среднее резидентное время, VRT – дисперсия среднего резидентного времени) рассчитываются с помощью численного интегрирования методом трапеций, показатели Cmax и Tmax фиксируются непосредственно по измеренным значениям. Обо всех полученных таким образом показателям для тестового препарата и стандарта предоставляется полная параметрическая (средние значения, дисперсии, коэффициенты вариации) и непараметрическая (максимальные и минимальные значения, размах, медианы, квартили) статистика. Информация предоставляется также об индивидуальных и средних различиях (или отношениях) показателей. Набор процедур для статистического анализа данных включает: анализ вариаций, построение доверительных интервалов (95 и 90%) параметрическими и непараметрическими способами, построение гистограмм распределения попарных геометрических средних индивидуальных отношений AUC и Cmax (в предположении их лог-нормального распределения), парный критерий Стьюдента и построение графиков индивидуальных различий.

Правильность работы программы BIOEQV была верифицирована по приведенным в статьях [30, 37] данным исследований и приведенным там же результатам, полученным с помощью другого программного обеспечения.

Так, для приведенных в работа [37] данных (значения AUC) исследования теофиллина, с учетом последовательности AB/BA, нами были получены результаты, представленные в таблицах 1-3 (рассчитанные значения полностью совпадают с приведенными в работе [37]). Все расчеты проводились в предположении лог-нормального распределения показателя AUC. Точечные и интервальные оценки средних отношений биодоступности, рассчитанные нами с помощью различных статистических процедур (таблица 4), также совпадают с представленными авторами работы [37]. Проведенный статистический анализ степени всасывания (показатель AUC) показал, что различия в терапиях не вносят существенный вклад в наблюдаемый разброс данных (ANOVA), точечные и интервальные оценки средних отношений биодоступности, полученные различными методами, находятся в заданных пределах биоэквивалентности, согласно парному критерию Стьюдента (t=0,33; 11 степеней свободы, 5% уровень значимости) среднее значение различий показателя lnAUC незначимо отличается от нуля. График на рисунке 1 демонстрирует симметричное распределение индивидуальных стандартизованных различий для показателя lnAUC вокруг нуля. Все стандартизованные значения различий располагаются в полосе [-2;2], что говорит об отсутствии резко отклоняющихся наблюдений. Надо заметить, что незначительное увеличение индивидуального отношения биодоступности, например, у 4 добровольца привело бы к необходимости статистической проверки резко выделяющегося наблюдения. Построенное распределение попарных геометрических средних индивидуальных отношений биодоступности (непараметрический тест) (см. рис. 2) демонстрирует симметрию такого распределения относительно точки эквивалентности (единицы) и отсутствие резко отличающихся подпопуляций пациентов, что также свидетельствует в пользу статистической гипотезы о биоэквивалентности сравниваемых препаратов.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры AUC [мг*ч/л] и ln AUC после получения 385,6 мг теофиллина натощак (А - стандарт) и после стандартного завтрака (В - тест) 12 добровольцами.


 

п/п

AUC, мг*ч/л

Ln AUC

A

B

A

B

1

135,7

136,0

4,91

4,9

2

155,3

152,6

5,05

5,03

3

139,2

115,7

4,94

4,75

4

91,7

72,0

4,52

4,28

5

133,2

151,1

4,9

5,02

6

150,3

156,1

5,01

5,05

7

223,9

222,4

5,41

5,4

8

154,1

158,1

5,04

5,06

9

148,9

123,1

5,0

4,81

10

81,2

77,0

4,4

4,34

11

118,7

116,4

4,78

4,76

12

115,6

118,9

4,75

4,78

X

137,32

133,28

4,89

4,85

S.D.

36,28

40,01

0,26

0,31

Var, %

26,4

30,01

5,38

6,42

Геом.ср.

133,0

127,7

 

 

Max

223,9

222,4

5,4

5,4

Min

81,2

72,0

4,4

4,3

Размах

142,7

150,4

1,01

1,13

Медиана

135,7

123,1

4,91

4,81

Кв.75%

150,3

152,6

5,01

5,03


Таблица 2. Рассчитанные индивидуальные и среднее значения отношений биодоступности (AUCtest/AUCstandard) в предположении лог-нормального распределения показателя AUC (мультипликативная модель).

п/п

AUCtest/AUCstandard

1

1,0

2

1,02

3

1,2

4

1,27

5

0,88

6

0,96

7

1,01

8

0,97

9

1,21

10

1,05

11

1,02

12

0,97

X

1,04 (геом. ср.)

S.D.

0,12

Таблица 3. Таблица дисперсионного анализа для показателя lnAUC, рассчитанная программой BIOEQV. Все факторы, кроме межиндивидуальной вариабельности, вносят статистически незначимый вклад в общую вариацию

Источник вариации

Сумма квадратов отклонений

Число степеней свободы

Средний квадрат

F - значение

Терапии

0,010

1

0,010

1,56

Периоды

0,000

1

0,000

0,025

Субъекты

1,763

11

0,160

24,55(p<0,001)

Остаточная

0,065

10

0,007

 

Общая

1,838

23

 

 

Таблица 4. Точечные и интервальные оценки для средних отношений биодоступности (AUCtest/AUCstandard)

Статистический метод

Точечная оценка

Доверительный 95% интервал

Парный критерий Стьюдента (lnAUC)

1,04

0,97 – 1,12

Анализ вариаций (lnAUC)

1,04

0,96 – 1,13

Непараметрический критерий Уилкоксона

1,02(медиана)

0,97 – 1,11

Рисунок 1. График значений индивидуальных стандартизованных различий показателя lnAUC

Рисунок 2. Гистограмма распределения попарных геометрических средних индивидуальных отношений биодоступности

Литература

  1. Методические рекомендации по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов // МЗ РФ, Москва, 2001.
  2. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. «Математическая статистика в клинических исследованиях» // «Гэотар Медицина», Москва, 2000.
  3. Benet LZ., Goyan JE. «Bioequivalence and Narrow Therapeutic Index Drugs» // Pharmacotherapy 15(4): 433-440, 1995.
  4. Chen M-L, Patnaik R, Hauck WW, et al. «An Individual Bioequivalence Criterion: Regulatory Consideration» // Statistics in Medicine 19(20): 2821-2842, 2000.
  5. Diletti E., Hauschke D., Steinijans V.W. «Sample Size Determination for Bioequivalence Assessment by Means of Confidence Intervals» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 29(1): 1-8 , 1991.
  6. Diletti E., Hauschke D., Steinijans V.W. «Sample Size Determination: Extended Tables for the Multiplicative Model and Bioequivalence Ranges of 0.9 to 1.11 and 0.7 to 1.43» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 30(8):287-290, 1992.
  7. Endrenyi L., Fritsch S, Yan W. «Cmax/AUC Is a Clearer Measure Than Cmax for Absorption Rates in Investigations of Bioequivalence» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 29(10): 394-399, 1991.
  8. Endrenyi L., Taback N., Tothfalusi L. «Properties of the Estimated Variance Component for Subject-by-formulation Interaction in Studies of Individual Bioequivalence» // Statistics in Medicine 19(20): 2867-2878, 2000.
  9. Esinhart J.D., Chinchilli V.M. «Sample Size Considerations for Assessing Individual Bioequivalence Based on the Method of Tolerance Intervals» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 32(1): 26-32 , 1994.
  10. Fluehler H., Hirtz J., Moser H.A. «An Aid to Decision - Making in Bioequivalence Assessment» // J Pharmacokin Biopharm 9(2): 235-243, 1981.
  11. Gould AL. «Discussion of Individual Bioequivalence by M.-L. Chen» // J Biopharm Stat 7(1): 23-29, 1997.
  12. Gould AL. «A Practical Approach for Evaluating Population and Individuai Bioequavalence» // Statistics in Medicine 19(20): 2721-2740, 2000.
  13. Grieve A.P. «Evaluation of Bioequivalence Studies» // Eur J Clin Pharmacol 40: 201-203, 1991.
  14. Grizzle J.E. «The Two-Period Change-Over Design and Its Use in Clinical Trials» // Biometrics, June 1965.
  15. Hauck W.W., Anderson S. «Types of Bioequivalence and Related Statistical Considerations» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 30(5): 181-187, 1992.
  16. Hauschke D., Steinijans V.W. «The U.S. Draft Guidance Regarding Population and Individual Bioequivalence Approaches: Comments by Research-based Pharmaceutical Company» // Statistics in Medicine 19(20): 2769-2774, 2000.
  17. Hauschke D., Steinijans V.W., Diletti E., et al «Presentation of the Intrasubject Coefficient of Variation for Sample Size Planning in Bioequivalence Studies» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 32(7): 376 - 378, 1994.
  18. Hills M., Armitage P. «The Two-Period Cross-Over Clinical Trial» // Br J Clin Pharmac 8: 7-20, 1979.
  19. Hsuan FC. «Some Statistical Considerations on the FDA Draft Guidance for Individual Bioequivalence» // Statistics in Medicine 19(20): 2879-2884, 2000.
  20. In vivo bioequivalence guidance’s // U.S. Pharmacopeia 24-NF 19, National Formulary, Supplement 1090, 2000.
  21. Ju H.L. «On TIER Method for Assessment of Individual Bioequivalence» // J Biopharm Statist, 7(1): 63-85, 1997.
  22. Liu J.P., Chow S-C. «A Two One-Sided Tests Procedure for Assessment of Individual Bioequivalence» // J Biopharm Stat 7(1): 49-61, 1997.
  23. Liu J.P., Weng C.S. «Estimation of Direct formulation Effect under log Normal Distribution in Bioavailability/Bioequivalence Studies» // Statistics In Medicine 11: 881-896, 1992.
  24. Lund RE. «Tables for an Approximate Test for Outliers in Linear Models» // Technometrics, Vol. 17(4): 473-476, 1975.
  25. Mandallaz D., Mau J. «Comparison of Different Methods for Decision-Making in Bioequivalence Assessment» // Biometrics 37: 213-222, 1981.
  26. Pabst G., Jaeger H. «Review of Methods and Criteria for the Evaluation of Bioequivalence Studies» // Eur J Clin Pharmacol 38: 5-10, 1990.
  27. Phillips K.F. «Power of the Two One-Sided Tests Procedure in Bioequivalence» // J pharmacokin Biopharm 18(2): 137-144, 1990.
  28. Rescigno A. «Rate of Absorption» // Pharmacological Research 35(1): 5-6, 1997.
  29. Rescigno A., Powers J.D. «AUC and Cmax Are Not Sufficient to Prove Bioequivalence» // Pharmacological Research 37(2):93-95, 1998.
  30. Sauter R., Steinijans VW., Diletti E., et al. «Presentation of Results from Bioequivalence Studies» // Internat J Clin Pharmacol, Ther and Toxicol 30(7): 233-256, 1992.
  31. Schuirmann D.J. «A Comparison of the Two One-Sided Tests Procedure ana Power Approach for Assessing the Equivalence of Average Bioavailability» // J Pharmacokin Biopharm 15(6): 657-680, 1987.
  32. Selwyn MR., Dempster AP., Hall NR. «A Bayesian Approach to Bioequivalence for 2X2 Changeover Design» // Biometrics 37: 11-21, 1981.
  33. Steinijans VW., Hauschke D. «International harmonization of Regulatory Requirements» // Clinical Research and Regulatory Affairs 10: 203-220, 1993.
  34. Steinijans VW., Hauschke D., Schall R. «International harmonization of Regulatory Requirements for Average Bioequivalence and current Issue in Individual Bioequivalence» // Drug Information Journal 29: 1055-1062, 1995.
  35. Steinijans VW., Hauschke D. «Update on Statictical Analysis of Bioequivalence Studies» // Intern J Clin Pharmacol, Ther and Toxicology 28(3): 105-110, 1990.
  36. Steinijans VW., Diletti E. «Generalization of Distribution-Free Confidence Intervals for Bioavailability Ratios» // Eur J Clin Pharmacol 28: 85-88, 1985.
  37. Steinijans VW., Diletti E. «Statistical Analysis of Bioavailability Studies: Parametric and Nonparametric Confidence Intervals» // Eur J Clin Pharmacol 24: 127-136, 1983.
  38. Wellek S. «A Comment on So-Called Individual Criteria of Bioequivalence» // J Biopharm Stat 7(1): 17-21, 1997.
  39. Westlake WJ. «Response to Bioequivalence Testing: a need to rethink» // Biometrics 37: 591-993, 1981.
  40. Westlake WJ. «Symmetrical Confidence Intervals for Bioequivalence Trials» // Biometrics, 32: 741-744, 1976.
  41. Yafune A., Ishiguro M. «Bootstrap Approach for Constructing Confidence Intervals for Population Pharmacokinetic Parameters. I: a Use of Bootstrap Standard Error» // Statistics in Medicine 18(5): 581-599, 1999.

 

Похожие статьи