Дозозависимый хемотранскриптомный анализ дифференциального действия витамина D на экспрессию генов в клетках-предшественниках нейронов NPC и в опухолевых клетках MCF7 человека
Вс, 10 Фев 2019
231

Резюме. Различные типы клеток по-разному откликаются на воздействие витамина D3. В работе представлены результаты дозозависимого дифференциального хемотранскриптомного анализа холекальциферола по отношению к клеткам опухоли молочной железы (линия MCF7) и к клеткам-предшественникам нейронов (линия NPC). В опухолевых клетках достоверно повышалась экспрессия генов, вовлечённых в иммуномодуляцию (192 гена) и во внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов (275 генов), и снижалась экспрессия генов, вовлечённых в поддержание энергетического метаболизма (482 гена), деление/пролиферацию клеток (387 генов), ремонт ДНК (391 ген), синтез и транспорт белков (188 генов) и в поддержание хронического воспаления (факторы ФНО/NF-kB, 105 генов). В нейрональных клетках схожие изменения в экспрессии этих категорий генов происходили в значительно меньшей степени и не достигали статистической значимости. Снижение ремонта ДНК в опухолевых клетках стимулирует их апоптоз, снижение энергетического метаболизма снижает способность опухолевых клеток к делению и к сопротивлению терапевтическому воздействию. Интересно отметить, что витамин D3 способствовал снижению экспрессии генов, поддерживающих клеточный ответ на гамма-излучение (9 генов) и способствовал усилению противоопухолевых эффектов витамина А (5 генов). Также, витамин D3 снижал экспрессию генов, ингибиторы белков которых являются перспективными противоопухолевыми препаратами (казеинкиназа, c-src тирозинкиназа, c-myc и др). Таким образом, витамин D3 дозозависимо подавлял деление именно опухолевых клеток, не оказывая негативного воздействия на выживаемость нейронов.

Dose-dependent chemotranscriptomics analysis of the differential effects of vitamin D3 on gene expression in human neuronal progenitor cells NPC and in MCF7 tumor cells

Resume. Different cell types respond differently to the effects of vitamin D3. The paper presents the results of a dosedependent differential chemotranscriptome analysis of vitamin D3 in relation to breast tumor cells (MCF7 line) and neuron progenitor cells (NPC line). Expression of the genes involved in immunomodulation (192 genes) was significantly increased in tumor cells and in the intracellular signaling from receptors (275 genes) and the expression of genes involved in maintaining energy metabolism (482 genes), cell division / proliferation (387 genes), DNA repair (391 gene), synthesis and transport of proteins (188 genes) and in maintaining chronic inflammation (factors of TNF / NF-kB. 105 genes). In neuronal cells, similar changes in the expression of these categories of genes occurred to a much lesser extent and did not reach statistical significance. The reduction in DNA repair in tumor cells stimulates their apoptosis, the decrease in energy metabolism reduces the ability of tumor cells to divide and to resist therapeutic effects. It is interesting to note that vitamin D3 contributed to a decrease in the expression of genes supporting the cellular response to gamma radiation (9 genes) and contributed to the enhancement of the antitumor effects of vitamin A (5 genes). Also, vitamin D3 reduced the expression of genes that express potential target proteins of antitumor drugs (casein kinase, c-src tyrosine kinase, c-myc, etc.). Thus, vitamin D3 suppressed the division of tumor cells in a dose-dependent manner, without adversely affecting the survival of neurons.

Введение

Физиологическое воздействие витамина D3 не ограничивается общеизвестной ролью в регуляции гомеостаза кальция и фосфора, но также ассоциировано с комплексом иммуномодулирующих, нейропротекторных, противоопухолевых свойств, влияниями на уровни факторов роста и обновления тканей, поддержание баланса между жировой и мышечной тканями, синтез гормонов, липидный метаболизм и др. [1].

Активация рецепторов VDR является наиважнейшим способом реализации биологических эффектов витамина D3, попадающего в ЖКТ в форме холекальциферола. Формирование нанодисперсной водной эмульсии является первым важным шагом усвоения витамина D3. Витамин D3 может поступать в ЖКТ уже в виде раствора мицелл (препарат «Аквадетрим») или же эмульгироваться внутри кишечника при участии желчных кислот в тонком кишечнике. Всасываясь из мицелл в кровь, холекальциферол поступает в печень и почки, посредством которых синтезируется наиболее биологически активный витамер D3 – кальцитриол (1,25-дигидроксивитамин D3 или «1,25(OH)2D3»). Биологическое воздействие активной формы витамина D3 оказывается через связывание с рецептором витамина D (VDR) [1, 2]. Рецептор витамина D, подобно стероидным и многим другим гормональным рецепторам, является фактором транскрипции, регулирующим экспрессию нескольких тысяч генов в геноме человека. Молекула рецептора включает витамин-связывающий и ДНК-связывающий домены (рис. 1).

 

Далеко не все роли витамина D были исследованы. Поэтому, исследования воздействий рецепторов VDR с геномной ДНК (полногеномные анализы) имеют важное значение для комплексной оценки физиологического воздействия витамина D на здоровье человека. В частности, системно-биологический анализ данных полногеномных исследований рецептора VDR, проведённых секвенированием посредством иммунопреципитации хроматина (технология ChIP-seq), указал на весьма широкий спектр потенциальных применений витамина D в терапии [3]. Было установлено потенциальное воздействие витамина D на транскрипцию около 2 700 генов человека. Была произведена рубрикация всех известных к настоящему времени специфических биологических ролей витамина D, которые включают поддержание стабильности генома (в т. ч. цикл деления клетки, ремонт ДНК, реструктурирование хромосом), поддержку процессов синтеза и деградации белков, иммунитета, регулировку эмбриогенеза, энергетический метаболизм. К геномным ролям витамина D также относятся: осуществление эффектов нейротрофических и ростовых факторов (в т. ч. инсулина), регуляция свертывания крови, гаметогенез и апоптоз (рис. 2). Результаты анализа также указали на эпигенетический потенциал витамина D, осуществляющийся посредством нормализации ацетилирования гистонов – специальных ДНК-стабилизирующих белков, и существенно расширили перспективы применений препаратов витамина D для профилактики и терапии широкого круга заболеваний [3].

С терапевтической точки зрения крайне важно знать о дифференцированном действии витамина D на различные типы клеток. Фармакологический опыт показывает, что подавляющее большинство синтетических лекарств действуют по очень узким молекулярным механизмам, ингибируя некоторые фиксированные белки (например, статины ингибируют HMG-CoA-редуктазу, цитотоксические противоопухолевые препарата ингибируют те или иные киназы и др.). Поэтому, ожидать существенных различий при воздействии на разные типы клеток, по умолчанию, не приходится.

В то же время, витамин D, действуя в значительной мере через одноименный рецептор (VDR), влияет на экспрессию (транскрипцию) нескольких тысяч генов. Поскольку на транскрипцию генов влияют и многие другие факторы, связанные с состоянием клетки, то эффекты витамина D будут в существенной мере зависеть от типа клеток. Наблюдаемые в экспериментальных и клинических исследованиях противоопухолевые эффекты витамина D указывают на ингибирование роста опухолевых клеток без какого-либо негативного воздействия на другие типы клеток. Поэтому, представляет интерес выяснить, каким именно образом осуществляется такое дифференцированное действие витамина D.

Изучение дифференцированного действия витамина D на опухолевые клетки особенно важно, принимая во внимание необходимость продолжительного использования препаратов витамина D. Дело в том, что формирование резистентности опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам осуществляется, в основном, на уровне протеома (cеквестрация и выведение лекарств, повышение активности ферментов, обеспечивающих метаболизм ксенобиотиков, повышение репарации ДНК, подавление апоптотических сигнальных каскадов, пребывание клетки вне фазы клеточного цикла, взаимодействие с ростовыми факторами и цитокинами) [4]. Поэтому, резистентность опухолевых клеток к действию того или иного препарата вырабатывается гораздо сложнее, если препарат не только «тактически» ингибирует тот или иной белок протеома, но, «стратегически» снижает экспрессию генов, важных для выживания и пролиферации опухолевых клеток (что и наблюдается в случае кальцитриола).

В настоящей работе представлены результаты хемотранскриптомного исследования дозозависимых эффектов воздействия кальцитриола на транскрипцию 12 700 аннотированных генов человека в клетках-предшественниках нейронов (линия NPC) и линии MCF7 опухолевых клеток молочной железы. Моделировалась стимуляция клеток кальцитриолом в 6 различных концентрациях в течение 24 ч. В результате проведённого анализа установлены функциональные группы генов и конкретные гены, экспрессия которых дозозависимо и достоверно изменяется под воздействием кальцитриола в двух исследованных типах клеток. Соответственно, была получена комплексная дифференциальная картина возможных воздействий кальцитриола на транс криптом опухолевых и нормальных клеток человека.

 Материалы и методы

Транскриптомные исследования лекарств in vitro требуют комплекса специального оборудования для анализа экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов, крайней аккуратности в выборе анализируемых клеточных культур, обработке получаемых данных и, поэтому, весьма дорогостоящи (от 10 000 до 20 000 евро на транскриптомное исследование только 1-й молекулы). В общем случае, такого рода исследования практически не доступны ни в России, ни за рубежом для подавляющего большинства врачей-исследователей.

В то же время, в базе данных GEO (Gene Expression Omnibus. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) накоплены результаты более чем 160 000 транскриптомных исследований (>50 000 терабайт транскриптомных данных). С использованием новейших методов искусственного интеллекта для анализа «сверхбольших данных» (big data) в Институте фармакоинфоматики при ФИЦ ИУ РАН был разработан метод хемотранскриптомного анализа эффектов молекул.

Результаты транскриптомных экспериментов  в базе данных GEO представлены в виде таблиц, столбцам которой соответствуют гены, а строкам – соответствующие воздействия на клетку (например, те или иные молекулы). Элементами таблицы являются изменения экспрессии гена при соответствующем воздействии. Каждой такой «таблице транскриптомного эксперимента» соответствуют (1) тип клеток, для которых изучались изменения экспрессии, (2) интенсивность воздействия (прежде всего, концентрации воздействующих молекул) и (3) время воздействия (6, 12, 24 ч и др.). Изменения экспрессии оцениваются относительно контроля (как правило, ДМСО, диметилсульфоксид).

При задании (1) типа клеток (например, фибробласты), (2) концентрации и (3) времени воздействия, каждый столбец такой таблицы соответствует химической реакции «Генi → мРНКi», в результате которой осуществляется синтез i-ой молекулы мРНКi, соответствующей i-ому гену (Генi). Данные, содержащиеся в таком столбце таблицы T транскриптомного эксперимента, включающей информацию об изменении экспрессии N генов при воздействии n молекул, могут рассматриваться как описание определённого элемента реактома (т. е. совокупности всех химических реакций). Соответственно, становится возможным применение теории хемографов [5], методологии хемоинформационного [6–9] и хемореактомного анализа [9–12] для осуществления хемотранскриптомного моделирования.

Хемотранскриптомный анализ. Исходной выборкой информации для обучения алгоритмов хемотранскриптомного анализа является i-й gi  (Xij ,ij )T столбец таблицы, T  ((Xij ,ij)), i  1,..., N , j  1,..., n соответствующий i-му гену и содержащий информацию о структуре j-й воздействующей молекулы (хемограф Xij ) и изменение транскрипции (экспрессии) генов при воздействии данной молекулы, ij  R . Хемограф (χ-граф) – особая разновидность графа (т. е. математического объекта, являющегося как совокупности множества вершин и множества ребер – связей между вершинами). Хемографом называется конечный, связный, неориентированный, размеченный граф без петель, с кликовым числом, не превышающим 3.

Данные, представленные в столбцах gi , обрабатываются методами хемоинформационного анализа, основанными на комбинаторной теории разрешимости [9–12]. Комбинаторная теория разрешимости, представляющая собой развитие алгебраического подхода к задачам распознавания, является современным математическим инструментом для исследования признаковых описаний объектов. В применении к анализу хемографов, практически важны теорема о полноте кортежей инвариантов произвольного хемографа и теорема соответствия критерия полноты инварианта критерию разрешимости/регулярности [5, 9], на основании которых становиться возможным определение и настройка («обучение») функций расстояния между хемографами.

Расстояние χd является настраиваемой метрикой, т. к. содержит произвольно настраиваемые параметры – веса kω . Для набора данных, заданных i-м столбцом ( ig ) таблицы T  транскриптомного эксперимента, настройка вектора параметров ( ) kωм ожет осуществляться теми или иными методами машинного обучения. Мы используем метод хемометрического анализа, который подразумевает использование процедуры согласования пар метрик, одной из которых является «химическое расстояние» χd , а второй – метрика Δd , вычисляемая на основе значений изменений экспрессии ijΔ , представленных в столбце ig . Согласование заключается в подборе таких значений веса kω , при которых различия между значениями согласуемой пары метрик, χd и Δd , минимально.

Задача машинного обучения для согласования метрик формулируется как [ dd ] iNjnijijijijkargmin(L (X ,X ), ( , ) , 1,..., , 1,..., ( ) ΔΔ = = χΔω, где L – используемая функция потерь (сумма квадратов невязок, стандартное отклонение и т. п.). Соответственно, в результате обучения алгоритма «химическое расстояние» (X ,X ) i1 i2 dχ между парой молекул 1 Xi и 2 Xi соответствует различию значения в значениях изменений экспресии i1 Δи i2 Δ , отражаемых метрикой ( , ) i1 i2 dΔΔΔ с точностью до линейного преобразования iy , т. е. Δ →Δ →ΔΔΔ = = + χχχχdydadbiiiiiii ( , ) ( (X ,X ) (X ,X ) 1 2 1 2 1 2 →Δ + χb .

В целом, на первом этапе хемотранскриптомного анализа для i-го гена, описываемого столбцом таблицы T проводится обучение алгоритмов для вычисления химических расстояний χd.

На втором этапе, для исследуемой молекулы X считываются расстояния (X,X ) ijdχ до всех хемографов ijX столбца Tijijg (X , ) i = Δ и, по формуле ( ) χdydi = Δ , вычисляются оценки расстояний Δd от искомого изменения экспрессии XΔдо известных значений ijΔ столбца ig . Затем, для каждой j-й молекулы по формуле 1( , ) XjijΔ = ddΔΔ− вычисляются оценки искомого изменения экспрессии, образующие множество чисел { , ,... ,..., } X1 X2 XjXnA = ΔΔΔΔ , к которому применяется операторφˆ(x) для формирования эмпирической функции распределения (э. ф. р.) так, что RxAxaBaABAx∈ ≤ ∈ ∀ ⊆ = , / } : | { sup ) ( ˆφ . С использованием полученной э. ф. р. Ax) ( ˆφ искомое изменение экспрессии XΔ вычисляется как математическое ожидание Ax) ( ˆφ, а точность вычисления XΔ – как стандартное отклонение Ax) ( ˆφ . Представленные далее в таблицах и рисунках оценки изменений экспрессии различных констант были получены как математическое ожидание и дисперсия соответствующей эмпирической функции распределения. На третьем этапе, для исследуемой молекулы Xдля каждого гена вычисляются оценки ( ) XmΔc при различных концентрациях mc вещества X . Графики в координатах{( ( ), )} XmmΔcc анализируются методами регрессионного анализа и выявляются достоверные дозозависимые тренды изменения экспрессии в зависимости от mc . Отбираются только те кривые ( ) XmΔc , которые могут быть описаны достоверными линейными трендами (коэффициент корреляции 0,6 и более, p < 0,05 по критерию Колмогорова–Смирнова) во всём диапазоне исследуемых концентраций (0,01–10 мкмоль кальцитриола). Для каждого из отобранных трендов устанавливается знак изменения экспрессии i-го гена («+»-тренд – достоверное повышение экспрессии при увеличении концентрации кальцитриола, «-»-тренд – достоверное снижение экспрессии i-го гена при увеличении концентрации кальцитриола), и соответствующие трендам гены подразделяются на список генов, для которых показано достоверное повышение экспрессии, группу генов и список генов со сниженной экспрессией. К двум полученным спискам генов применяются методы системно-биологического анализа.

Системно-биологический анализ. Списки генов с достоверным повышением или снижением экспрессии генов, которые были получены в результате применения, описанного выше хемотранскриптомного подхода, анализировались посредством метода функционального связывания [2]. Анализ проводится с использованием международной номенклатуры GeneOntology (GO), описывающей физиологические функции генов и соответствующих белков. Данный  метод основан на системном рассмотрении органов, тканей, клеток и их мельчайших компонентов – белков, ДНК, метаболитов (в т. ч. витаминов и других микронутриентов), в рамках фундаментальных основ молекулярной биологии и биохимии. Так, на основе информации определённой геномной ДНК синтезируется соответствующий белок, выполняющий строго очерченный круг специфических функций. Как мутации гена, так и дефициты кофакторов белка (ионов металлов – кальция, магния, цинка, витаминов группы B и др.) будут приводить к падению активности тех или иных белков и проявлению той или иной специфической клинической симптоматики.

Метод анализа функциональных взаимосвязей, соединяя данные различных уровней (данные о моногенных заболеваниях, биохимические данные о кофакторах белков, данные о клеточных ролях белков, симптоматика и критерии диагностики заболеваний и т. д.), позволяет систематически рассмотреть все возможные функциональные эффекты воздействия кальцитриола на транскрипцию каждого из генов. В целом, при использовании метода анализа функциональных взаимосвязей для каждого гена человека составляется аннотированная таблица изменений экспрессии генов, включающая следующие описания [2]: соответствующий гену белок, список биохимически необходимых эссенциальных кофакторов белка (в т. ч. с указанием потребности ионов кальция для активности рассматриваемого белка), список моногенных заболеваний, связанных с полной или частичной потерей активности этого белка, список клеточных функций белка (по номенклатуре GO и др.), список отдельных симптомов заболеваний, список диагнозов по МКБ-10 и другая информация из баз данных.

Далее, в полученной таблице выделяются гены, частота встречаемости функциональных описаний которых существенно отличается при достоверном повышении экспрессии по сравнению с достоверным снижением экспрессии, и проводятся последующие анализы их функций на основании статистических критериев. Для статистической обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчёт числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия χ-квадрат, T-критерия Вилкоксона–Манна–Уитни и теста Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Хемотранскриптомный анализ (24 ч инкубации) показал достоверные дозозависимые эффекты витамина D3 на транскрипцию 3 620 генов в линии клеток MCF7 и 4 465 генов в линии клеток NPC. При этом изменения транскрипция 2 831 генов были приблизительно одинаковы в обеих линиях клеток. Достоверные дозозависимые изменения транскрипции соответствовали значению p < 0,05 (t-тест), модулю коэффициента корреляции более 0,5 и изменению транскрипции на 5 % или более в расчёте на 1 мкмоль витамина D3. Для опухолевых клеток MCF7 экспрессия 1 012 генов снизилась (список генов «MCF7-»), а экспрессия 2 607 генов повысилась (список «MCF7+»). В случае нейрональных клеток NPC экспрессия 2010 генов снизилась (список «NPC-»), а экспрессия  2 454 генов повысилась (список «NPC+»). Таким образом, даже наблюдаемые различия в числах генов указывают на дифференцированность воздействия витамина D3 на разные типы клеток.

Для установления более детальных закономерностей в группах генов, экспрессия которых дозозависимо повышалась или снижалась при моделировании воздействия витамина D3, был проведён сравнительный системно-биологический анализ четырёх списков генов. В ходе проведения системно-биологического анализа были выявлены различия в частоте встречаемости ключевых слов в описаниях генов (данные UNIPROT), функциональных категорий генов/белков по номенклатуре GO (Gene Ontology), данных о встречаемости различных кофакторов, ассоциированных с генами заболевания и элементы реактома человека.

Анализы с использованием функциональной аннотации генов по международной номенклатуре «GO» позволили установить дифференцированное действие витамина D на опухолевые клетки и на нейрональные клетки. Были установлены достоверные отличия в экспрессии генов, относящихся к 97 категориям номенклатуры «GO». Экспертный анализ позволил рубрицировать эти 97 категорий в 9 функциональных групп генов: «Синтез/транспорт белка», «Регуляция экспрессии генов», «Ремонт ДНК», «Энергетический метаболизм», «Деление клеток», «Воспаление», «Внутриклеточная передача сигнала», «Деградация белка», «Иммуномодуляция» (табл. 1, 2). На рис. 3 отражены профили частоты встречаемости генов этих 9 функциональных групп в зависимости от количественного изменения экспрессии гена на 1 мкмоль витамина D3.

Хемотранскриптомный анализ показал, что под воздействием витамина D3 в линии NPC нейрональных клеток может изменяться транскрипция гораздо большего числа генов (4 465 генов), чем в линии MCF7 опухолевых клеток (3 620 генов). Тем не менее, из 97 выявленных категорий функций генов по номенклатуре GO, достоверные изменения экспрессии генов из 73 категорий GO наблюдались исключительно в линии опухолевых клеток MCF7 (табл. 2), но не в линии нейрональных клеток (табл. 1). Таким образом, 74 категории генов, перечисленные в табл. 2, описывают дифференцированное противоопухолевое воздействие витамина D.

На рис. 4. отображены числа генов «n-» и «n+», соответствующие функциональным категориям генов, перечисленным в табл. 1 и 2. Анализ профилей частоты встречаемости генов 9 функциональных групп (рис. 4 и данных на рис. 5) позволяет утверждать, что в опухолевых клетках MCF7 систематически снижается экспрессия генов из групп «энергетический метаболизм», «деление/пролиферация клеток», «ремонт ДНК», «синтез и транспорт белков», «поддержание хронического воспаления». Одновременно, в опухолевых клетках достоверно повышалась экспрессия генов, вовлечённых в иммуномодуляцию и во внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов.

Таким образом, гены, экспрессия которых дозозависимо повышается при воздействии витамина D3, существенно  отличаются  по  своим биологическим функциям от генов, экспрессия которых  дозозависимо понижается (на что наглядно указывают диаграммы процентных соотношений функциональных групп генов, см. рис. 5). Установленные изменения транскрипции имеют важную физиологическую интерпретацию. Во-первых, хемотранскриптомный анализ витамина D3 в опухолевых клетках MCF7 указывает на систематическое снижение экспрессии генов, вовлечённых в синтез и транспорт белков (188 генов) и в деградацию белков (151 ген). Эти изменения соответствуют ингибированию гомеостаза белков: и новые белки синтезируются медленнее, и старые, дисфункциональные белки перерабатываются медленнее. Снижение протеасомального распада белков способствует снижению хронического воспаления (каскад NF-kB, см. далее) и, одновременно, увеличению продолжительности активации апоптотических сигнальных каскадов. Снижение синтеза белка (в т. ч. митохондриального синтеза белка, сплайсинг мРНК, транспорта и фолдинга белков) соответствует снижению количества ферментов, обеспечивающих метаболизм ксенобиотиков (в т. ч. противоопухолевых средств) и количества белков, участвующих в энергетическом метаболизме клетки (синтез АТФ). Во-вторых, под воздействием витамина D3 установлено выраженное снижение экспрессии генов, вовлечённых в энергетический метаболизм (482 гена, нейрональные клетки – только 20 генов, табл. 1, 2). Снижение экспрессии этих категорий генов (в т. ч. генов, кодирующих митохондриальные комплексы дыхательной цепи, ферменты окислительного фосфорилирования, метаболизма глюкозо-6-фосфата, НАДФ-дегидрогеназу и др. (табл. 2) соответствует снижению обеспеченности опухолевых клеток АТФ. Иначе говоря, витамин D3 дифференцированно снижает энергообеспеченность             именно               опухолевых клеток, что способствует снижению интенсивности процессов пролиферации и сопротивляемость опухолевых клеток к терапевтическому воздействию.

В-третьих, витамин D3 способствует снижению транскрипции генов, непосредственно вовлечённых собственно в пролиферацию опухолевых клеток (387 генов, нейрональные – 324 гена) и в процессы ремонта ДНК (391 ген, нейрональные – 101 ген). Белки, соответствующие этим генам, осуществляют такие фундаментальные процессы, как поддержание целостности теломер, ремонт ДНК, активность сигнального пути рецептора фактора роста фибробластов, метаболизм фолиевой кислоты и др. (табл. 1, 2). Снижение активности теломеразы соответствует уменьшению числа возможных делений клетки, а снижение ремонта ДНК является одним из механизмов преодоление резистентности опухолевых клеток к терапии [4]. Снижение ремонта ДНК в опухолевых клетках стимулирует их апоптоз, усиливая эффекты снижения синтеза АТФ. В-четвёртых, хемотранскрипционный анализ указал на снижение транскрипции генов из функциональной группы «Хроническое воспаление» (MCF7 – 105 генов, нейрональные клетки – 37 генов). Гены этой группы вовлечены преимущественно в осуществление биологических эффектов провоспалительных факторов ФНО-альфа и NF-kB. Установлено, что витамин D действительно ингибирует эффекты провоспалительного транскрипционного фактора NF-kB [1]. Результаты хемотранскриптомного анализа показывают, что данный механизм действия витамина D3 осуществляется посредством предотвращения протеасомной деградации регуляторного белка Iκ-B и торможения транслокации NF-kB внутрь клеточного ядра. Взаимодействуя с регулятором Iκ-B, транскрипционный фактор NF-kB не может перемещаться в клеточное ядро и активировать экспрессию генов, опосредующих провоспалительные эффекты цитокина ФНО-альфа.

В-пятых, под воздействием витамина D3 в опухолевых клетках MCF7 достоверно повышалась экспрессия генов, вовлечённых в иммуномодуляцию (192 гена) и во внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов (275 генов). Экспрессия этих категорий генов повышалась и в нейрональных клетках, но в значительно меньшей степени (иммуномодуляция – 31 ген, внутриклеточная передача сигналов – 38 генов). Повышение экспрессии этих групп генов соответствует дифференцированному противоопухолевому действию витамина D.

Иммуномодуляция витамином D при воздействии на опухолевые клетки заключается в снижении хронического воспаления (экспрессия 9 генов отрицательной регуляции IkB-киназы/NF-kB и 4 генов отрицательной регуляции импорта NF-kappaB в ядро клетки) на фоне активации лимфоцитарного иммунного ответа. В опухолевых клетках MCF7 отмечено преимущественное повышение экспрессии генов, поддерживающих адаптивный иммунный ответ (31 ген), хемотаксис нейтрофилов (13 генов) и сигнальный путь интерлейкина-7 (8 генов). Интерлейкин-7 играет исключительно важную роль в делении и вызревании клеток лимфоидного ряда; дефицит интерлейкина-7 может быть одной из причин тяжёлого комбинированного иммунодефицита [13]. Интенсификация внутриклеточной          передачи сигнала также соответствует противоопухолевому действию витамина D. Опухолевые заболевания характеризуются выраженной активацией пролиферативных сигнальных каскадов на фоне блокады каскадов, регулирующих дифференцировку клеток [14]. Поэтому, в ходе противоопухолевой терапии необходима поддержка внутриклеточной передачи сигнала, поддерживающей дифференциацию клеток.

В клетках MCF7 витамин D3 стимулирует экспрессию генов, поддерживающих положительную регуляцию клеточной дифференциации (категория [GO:0045597], 7 генов). В частности, каскад JAKSTAT (8 генов) стимулирует дифференциацию клеток эпителия молочных желёз [15]. Стимулируя, экспрессию генов в категории [GO:0030574] «катаболизм коллагена» (13 генов), витамин D снижает жёсткость внеклеточного матрикса вокруг опухолевых клеток. Известно, что повышенная механическая жёсткость внеклеточного матрикса вызывает механосенситивную передачу сигнала в мезенхимальных клетках, которая стимулирует пролиферацию клеток опухолей молочной железы [16]. Кроме того, рецепторы ретиноидов (категория [GO:0001972] «связывание рецепторами ретиноидов») способствуют подавлению роста опухолей через сигнальные каскады p53/p21/p16 и PI3K-AKT, способствуя ингибированию метаболизма углеводов опухолевых клеток и нормализации процессов дифференциации [17]. Таким образом, витамин D способствует усилению противоопухолевых эффектов витамина А.

Крайне интересно отметить, что витамин  D способствовал снижению экспрессии генов, поддерживающих клеточный ответ на гамма-излучение (категория [GO:0071480], 9 генов). Например, витамин D3 способствует снижению экспрессии гена ATR (в среднем, на 8 % на 1 мкмоль витамина D3). Это ген кодирует одноимённый белок ATR – серин/треониновую протеинкиназу, которая действует как датчик повреждения ДНК и активирует внутриклеточную сигнализацию при ионизирующем излучении или ультрафиолетовом излучении. ATR фосфорилирует белки BRCA1, CHEK1,  MCM2,  RAD17,  RPA2,  SMC1,  p53/TP53, гистоны H2AX/H2AFX, тем самым регулируя механизм ответа на повреждение ДНК [18, 19]. Витамин D3 также снижает экспрессию генов (TMEM109, трансмембранный белок 109, опосредует клеточный ответ на повреждение ДНК излучением [20]), XRCC5 (белок ремонта ДНК, участвует в стабилизации повреждённых концов ДНК [21]), GTF2H5 (транскрипционный фактор, восстанавливает повреждения нуклеотидов) и др. Снижение экспрессии генов этой функциональной категории способствует усилению отклика опухолевых клеток на радиотерапию.

В заключение приведём ещё несколько примеров конкретных генов, экспрессия которых дозозависимо изменялась при хемотранскриптомном моделировании эффектов витамина D на опухолевые клетки MCF7. Витамин D снижал экспрессию генов, ингибиторы белков которых являются перспективными противоопухолевыми препаратами (казеинкиназа, c-src тирозинкиназа, c-myc и др. – см. табл. 3. и рис. 5).

Следует отметить, что многие из перечисленных в табл. 2 и на рис. 4–6 изменений транскрипции генов под воздействием витамина D3 соответствуют действию уже имеющихся или перспективных противоопухолевых препаратов. Например, снижение транскрипции гена CSNK1A1 (-46,48 % на 1 мкМ), кодирующего казеинкиназу альфа-1, соответствует снижению количества молекул этого фермента в клетке. Казеинкиназы участвуют в передаче сигналов Wnt посредством фосфорилирования белков, а ингибиторы казеинкиназ – перспективные противоопухолевые препараты [22]. Повышение транскрипции гена CTNNBIP1 (11,98 % на 1 мкМ) соответствует увеличению общей внутриклеточной активности бета-катенин-взаимодействующего белка 1, который действует как отрицательный регулятор сигнального пути Wnt. Многие ингибиторы пути Wnt используются как противоопухолевые средства [23].

Снижение транскрипции генов CSK (-32,45 % на 1 мкМ), MYCBP (-20,41 % на 1 мкМ) и MTHFD1 (-29,55 % на 1 мкМ) также соответствует действию противоопухолевых средств. Ген CSK кодирует c-src тирозинкиназу, которая участвует в регуляции роста дифференцировки, миграции клеток и иммунного ответа (фосфорилирует киназы LCK, SRC, HCK, FYN, LYN и подавляет передачу сигналов различными рецепторами [24]. Ген MYCBP, кодирующий c-myc-связывающий белок, необходим для активирации транскрипционной активности MYC-киназы. Ингибиторы MYC-киназы – перспективные противоопухолевые средства. Ген MTHFD1 кодирует метилентетрагидрофолат дегидрогеназу, участвующую в эндогенном синтезе биологически активных фолатов. Как известно, антифолиевые препараты (метотрексат, триметоприм, азатиоприн, азидотимидин) являются противоопухолевыми препаратами.

Витамин D способствует снижению транскрипции генов, участвующих в метаболизме стероидных гормонов. Ген ZDHHC7 (-24,25 % на 1 мкМ) кодирует «цинковый палец» ZDHHC7, который необходим для пальмитоилирования рецепторов эстрогенов (ESR1), прогестерона (PGR) и андрогенов (AR), направляя их в плазматическую мембрану клетки и, тем самым, усиливая действие этих стероидов на клетку [25]. Одновременно снижается транскрипция гена HSD17B10 (-23,67 % на 1 мкМ), кодирующего гидроксистероид-17-бета дегидрогеназу 10, катализирующую 17-бета-окисление андрогенов и эстрогенов. Противодействие витамином D эффектам стероидных гормонов особенно важно для такой эстроген-зависимой опухолевой линии клеток, как MCF7 [25].

Витамин D также способствует повышению транскрипции генов, кодирующих белки с известным противоопухолевым действием: RASSF4 (12,50 % на 1 мкМ, белок «Ras-ассоциированный домен 4» – супрессор роста опухолей, способствующий остановке цикла деления клетки и апоптозу [26]), DDIT4 (14,52 % на 1 мкМ, «транскрипт-4, индуцируемый повреждением ДНК» – ингибирует mTORC1 через сигнальный путь AKT1-TSC1/2RHEB, активирует апоптоз в ответ на повреждение ДНК [27]), SLURP1 (18 % на 1 мкМ, белок SLURP1 обладает противоопухолевой активностью [28]) и др. Таким  образом, хемотранскриптомный анализ витамина D3 указал на характерные изменения транскрипции  генов,  способствующие снижению интенсивности метаболизма белков и ДНК, снижению пролиферации клеток и хронического воспаления и, в целом, противоопухолевым эффектам. При этом было показано дифференциальное действие витамина D3 именно на опухолевые клетки (MCF7); на нейроны витамин D3, наоборот, оказывал разноплановое цитопротекторное действие.

Противоопухолевое действие витамина D3 в составе «Аквадетрима» было продемонстрировано экспериментально. Исследование было проведено на 50 самцах мышей-гибридов F1 (возраст 2,5–3 мес., масса тела 26–29 г). В качестве опухолевой модели использована перевиваемая эпидермоидная карцинома лёгких Льюис (КЛЛ). Подопытные животные легко переносили препарат, не было отмечено каких-либо симптомов интоксикации. Воздействие препарата до 13 сут. развития КЛЛ сопровождалось нарастающей тенденцией торможения роста опухоли на 25–30 % (р = 0,016). В группе животных, получавших Аквадетрим, наблюдались отчётливые признаки подавления процессов метастазирования – число малых метастазов статистически значимо снижалось на 35–40 % (p < 0,05) [29]. Таким образом, препарат Аквадетрим, действующим началом которого является витамин D в водном растворе мицелл, достоверно подавляет процессы метастазирования карциномы лёгких Льюис. Результаты хемотранскриптомного исследования указывают на механизмы дифференциального противоопухолевого воздействия препарата.

Заключение

Исследование транскриптомных эффектов препаратов представляет собой «передовой фронт» современной молекулярной фармакологии и позволяют установить неочевидные механизмы действия препаратов, более детально очертить спектр патологий, на которые может благоприятно воздействовать исследуемая молекула. Как правило, для подавляющего большинства имеющихся на рынке лекарств данные о воздействии на транскриптом отсутствуют. В то же время изучать эффекты лекарств на транскрипцию генов крайне важно, т. к. транскриптомные исследования указывают на долговременные последствия приёма лекарств [2]. Изучение долговременных, транскриптомных эффектов прогормона витамина D особенно важно в случае его противоопухолевых активностей.

В настоящей работе представлены результаты дифференциального хемотранскриптомного анализа витамина D3 (Аквадетрим) по отношению к клеткам опухоли молочной железы (линия MCF7) и к клеткам-предшественникам нейронов (линия NPC) в условиях инкубации клеток с витамином D3 в течение 24 ч. Достоверные дозозависимые эффекты влияния витамина D3 на транскрипцию генов (что соответствует изменению транскрипции на 5 % или более на 1 мкмоль витамина D3) показаны для 3 620 генов в линии клеток MCF7 и для 4 465 генов в линии клеток NPC. При этом оценки изменений экспрессии 2 831 генов были приблизительно одинаковы в обеих линиях клеток. Анализы с использованием функциональной аннотации генов по международной номенклатуре «GO» позволили установить дифференцированное действие витамина D на опухолевые клетки и на нейрональные клетки. Были установлены достоверные отличия в экспрессии генов, относящихся к 97 категориям номенклатуры «GO». В опухолевых клетках достоверно повышалась экспрессия генов, вовлечённых в иммуномодуляцию (192 гена) и во внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов (275 генов). Экспрессия этих категорий генов повышалась и в нейрональных клетках, но в значительно меньшей степени (иммуномодуляция – 31 ген, внутриклеточная передача сигналов – 38 генов). В опухолевых клетках существенно снижалась экспрессия генов, вовлечённых в поддержание энергетического метаболизма (482 гена), деление/пролиферацию клеток (387 генов), ремонт ДНК (391 ген), синтез и транспорт белков (188 генов)  и  в  поддержание  хронического воспаления (факторы ФНО/NF-kB, 105 генов). В нейрональных клетках количества генов в этих категориях были существенно ниже (энергетический метаболизм – 20 генов, пролиферация клеток – 324 гена, ремонт ДНК – 101 ген, синтез/транспорт белков – 67 генов, поддержание воспаления – 37 генов). Снижение ремонта ДНК в опухолевых клетках стимулирует их апоптоз, снижение энергетического метаболизма снижает способность опухолевых клеток к делению и к сопротивлению терапевтическому воздействию. Интересно отметить, что витамин D3 способствовал снижению экспрессии генов, поддерживающих клеточный ответ на гамма-излучение (9 генов) и способствовал усилению противоопухолевых эффектов витамина А (5 генов). Также витамин D снижал экспрессию генов, ингибиторы белков которых являются перспективными противоопухолевыми препаратами (казеинкиназа, c-src тирозинкиназа, c-myc и др.). Таким образом, витамин D3 в существенной мере подавляет деление именно опухолевых клеток, одновременно профилактируя неврологические осложнения противоопухолевой терапии.

Работа    выполнена       при        поддержке       гранта РФФИ17-07-00935.

Литература / References

1.               Громова О.А., Торшин И.Ю. Витамин D. Смена парадигмы / под ред. Е.И. Гусева, И.Н. Захаровой. – М.: ГЭОТАР-Медиа; 2017. – 568 с. [Gromova OA, Torshin IYu. Vitamin D. Smena paradigmy. Ed by EI Guseva, IN Zakharova. Moscow: GEOTAR-Media; 2017. (In Russ).]. ISBN 978-5-9704-4058-2.

2.               Torshin IYu. Sensing the change: from molecular genetics to personalized medicine. Nova Biomedical Books. NY. USA. 2009. In “Bioinformatics in the Post-Genomic Era” series. ISBN 1-60692-217-0.

3.               Громова О.А., Торшин И.Ю., Спиричев В.Б. Полногеномный анализ сайтов связывания рецептора витамина D указывает на широкий спектр потенциальных применений витамина D в терапии // Медицинский совет. – 2016. – №1. – С.12–21. [Gromova OA, Torshin IY, Spirichev VB. The genome-wide analysis of the vitamin D receptor binding sites evidences a wide range of potential therapeutic applications of vitamin D. Meditsinskiy Sovet. 2016;1:12–21. (In Russ).]. DOI:10.21518/2079701X-2016-1-12-21

4.               Свирновский А.И. Резистентность опухолевых клеток к терапевтическим воздействиямкак медико-биологическая проблема. Международные обзоры: клиническая практика и здоровье. – 2014. –              Т.11. – №5. – С.15–38. [Svirnovski AI. Rezistentnost’ opukholevykh kletok k terapevticheskim vozdejstviyamkak mediko-biologicheskaya problema. Mezhdunarodnye obzory: klinicheskaya praktika i zdorov’e. 2014;11(5):15–38. (In Russ).]. DOI: 10.21518/2079-701X-2016-1-12-21

5.               Torshin IY, Rudakov KV. On the application of the combinatorial theory of solvability to the analysis of chemographs. part 1: fundamentals of modern chemical bonding theory and the concept of the chemograph. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2014;24(1):11– 23. DOI: 10.1134/S1054661814010209

6.               Торшин И.Ю., Громова О.А., Федотова Л.Э., и др. Хемоинформационный анализ молекулы оротовой кислоты указывает на противовоспалительные. нейропротекторные и кардиопротекторные свойства лиганда магния // Фарматека. – 2013. – Т.266 – №13. – С.95– 104. [Torshin IYu, Gromova OA, Fedotova LE, et al. Chemoinformation analysis of orotic acid molecule indicates anti-inflammatory, neuroprotective and cardioprotective properties of the magnesium ligand. Pharmateca. 2013;266(13):95–104. (In Russ).]

7.               Torshin IY. The study of the solvability of the genome annotation problem on sets of elementary motifs. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2011;21(4):652–662. DOI: 10.1134/S1054661811040171

8.               Torshin IY,  Rudakov KV. Combinatorial analysis of the solvability properties of the problems of recognition and completeness of algorithmic models. part 1: factorization approach. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2017;27(1):16–28. DOI: 10.1134/S1054661817010151

9.               Torshin IY, Rudakov KV. On the application of the combinatorial theory of solvability to the analysis of chemographs: Part 2. Local completeness of invariants of chemographs in view of the combinatorial theory of solvability. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2014;24(2):196–208. DOI: 10.1134/S1054661814020151

10.             Громова О.А., Торшин И.Ю., Федотова Л.Э., Громов А.Н. Хемореактомный анализ сукцината этилметилгидроксипиридина // Неврология. нейропсихиатрия. психосоматика. – 2016. – T8. –    N3. –С.53–60. [Gromova OA, Torshin IYu, Fedotova LE, Gromov AN. Chemoreactome analysis of ethylmethylhydroxypyridine succinate. Nevrologiya, neiropsikhiatriya, psikhosomatika. Neurology, neuropsychiatry, psychosomatics. 2016;8(3):53–60. (In Russ).]. DOI: http://dx.doi. org/10.14412/2074-2711-2016-3-53-60

11.             Громова ОА. Торшин ИЮ. Федотова ЛЭ. Геронтоинформационный анализ свойств молекулы мексидола // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. – 2017; – Т.9. – №4. – С.46–54. [Gromova OA, Torshin IYu, Fedotova LE. Geriatric information analysis of the molecular properties of mexidole. Nevrologiya, neiropsikhiatriya, psikhosomatika. 2017;9(4):46–54. (In Russ).]. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/2074-27112017-4-46-54

12.             Торшин И.Ю., Громова О.А., Сардарян И.С., Федотова Л.Э. Сравнительный хемореактомный анализ мексидола // Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова. – 2017. – Т.117. – №1- 2.          – С.75–83. [Torshin IYu, Gromova OA, Sardaryan IS, Fedotova LE. A comparative chemoreactome analysis of mexidol. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(1-2):75–83. (In Russ).]. DOI: 10.17116/jnevro20171171275-84

13.             Huang HY, Luther SA. Expression and function of interleukin-7 in secondary and tertiary lymphoid organs. Semin Immunol. 2012;24(3):175– 89. DOI: 10.1016/j.smim.2012.02.008.

14.             Sever R, Brugge JS. Signal transduction in cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015;5(4). pii: 5/4/a006098.

15.             Thomas SJ, Snowden JA, Zeidler MP, Danson SJ. The role of JAK/STAT signalling in the pathogenesis. prognosis and treatment of solid tumours. Br J Cancer. 2015;113(3):365–71. DOI: 10.1038/bjc.2015.233

16.             Ishihara S, Inman DR, Li WJ, et al. Mechano-Signal Transduction in Mesenchymal Stem Cells Induces Prosaposin Secretion to Drive the Proliferation of Breast Cancer Cells. Cancer Res. 2017;77(22):6179–6189. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-0569

17.             Zhang R, Li H, Zhang S, et al. RXRalpha provokes tumor suppression through p53/p21/p16 and PI3K-AKT signaling pathways during stem cell differentiation and in cancer cells. Cell Death Dis. 2018;9(5):532. DOI: 10.1038/s41419-018-0610-1

18.             Zhang J, Bao S, Furumai R, et al. Protein phosphatase 5 is required for ATR-mediated checkpoint activation. Mol Cell Biol. 2005;25(22):9910– 9. DOI: 10.1128/MCB.25.22.9910-9919.2005

19.             Kang Y, Cheong HM, Lee JH, et al. Protein phosphatase 5 is necessary for ATR-mediated DNA repair. Biochem Biophys Res Commun. 2011;404(1):476–81. DOI: 10.1016/j.bbrc.2010.12.005

20.             Yamashita A, Taniwaki T, Kaikoi Y, Yamazaki T. Protective role of the endoplasmic reticulum protein mitsugumin23 against ultraviolet C-induced cell death. FEBS Lett. 2013;587(9):1299–303. DOI: 10.1016/j. febslet.2013.03.024

21.             Willis DM, Loewy AP, Charlton-Kachigian N, et al. Regulation of osteocalcin gene expression by a novel Ku antigen transcription factor complex. J Biol Chem. 2002;277(40):37280–91. DOI: 10.1074/jbc. M206482200

22.             Liu C, Li Y, Semenov M, et al. Control of beta-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism. Cell. 2002;108(6):837–847.

23.             Graham TA, Clements WK, Kimelman D, Xu W. The crystal structure of the beta-catenin/ICAT complex reveals the inhibitory mechanism of ICAT. Mol Cell. 2002;10(3):563–571.

24.             Sun G, Budde RJ. Expression. purification. and initial characterization of human Yes protein tyrosine kinase from a bacterial expression system. Arch Biochem Biophys. 1997;345(1):135–42. DOI: 10.1006/abbi.1997.0236

25.          Pedram A, Razandi M. Deschenes RJ. Levin ER. DHHC-7 and -21 are palmitoylacyltransferases for sex steroid receptors. Mol Biol Cell. 

Похожие статьи