Исследование острой и хронической токсичности готовой лекарственной формы ГК-2
Чт, 28 Нояб 2019
59

Резюме. В работе представлены данные доклинического исследования острой и хронической токсичности готовой лекарственной формы соединения ГК-2, обладающего нейропротективными свойствами. Установлено, что ГК-2 при его однократном внутривенном введении в максимально допустимых объёмах беспородным белым мышам и крысам обоего пола не вызывает гибели животных. Определены среднесмертельные дозы ГК-2 при внутрибрюшинном введении. В опытах на мышах у самок LD50 составила 15,4 (14,5–16,4) г/кг, у самцов LD50 – 15,7 (14,6–16,9) г/кг. В опытах на крысах у самок и самцов LD50 составила 6,9 (4,5–10,6) г/кг. Ежедневное внутривенное введение готовой лекарственной формы беспородным белым крысам и кроликам породы шиншилла обоего пола в течение одного месяца в дозе, соответствующей терапевтической – 1 мг/кг (в пересчёте на активное вещество) и превышающей её в десять раз – 10 мг/кг (в пересчёте на активное вещество) позволило установить, что ГК-2 не влияет на интегральные показатели. Исключение составили снижение прироста массы тела и дозозависимое снижение потребления корма и воды у самок крыс опытных групп. При клинико-лабораторном, патоморфологическом и гистологическом исследованиях, выполненных в соответствии с общим протоколом, токсических эффектов ГК-2 не установлено.

Resume. The paper presents the data of preclinical studies of the acute and chronic toxicity of the finished dosage form of the compound GK-2, which has neuroprotective properties. It has been established that GK-2 does not cause the death of animals after a single intravenous administration in the maximum allowable volumes to outbred white mice and rats of both sexes. The average lethal doses of HA-2 were determined for intraperitoneal administration. In experiments on mice in females, the LD50 was 15.4 (14.5-16.4) g / kg. In males, the LD50 is 15.7 (14.6-16.9) g / kg. In experiments on rats in females and males, the LD50 was 6.9 (4.5-10.6) g / kg. Daily intravenous administration of the finished dosage form to purebred white rats and rabbits of the chinchilla breed of both sexes for one month at a dose corresponding to therapeutic - 1 mg / kg (in terms of active substance) and exceeding it ten times - 10 mg / kg (in terms of active substance) allowed to establish that GK-2 does not affect the integral indicators. The exceptions were reduced body weight gain and a dose-dependent decrease in feed and water intake in female rats of the experimental groups. In clinical, laboratory, pathological and histological studies performed in accordance with the general protocol, the toxic effects of GK-2 have not been established.

Введение

В ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАН был синтезирован дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов с химической структурой гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинилL-глутамил-L-лизина). Исследования фармакологической активности этого соединения, получившего обозначение ГК-2, показали перспективы его разработки в качестве нейропротектора и инициировали широкие исследования этого лекарственного кандидата [1]. Одним из обязательных фрагментов подобной работы являются доклинические токсикологические исследования, в частности, оценка повреждающего действия лекарственного кандидата при его однократном (острая токсичность) и многократном повторном (хроническая токсичность) введении [2, 3]. Значимость подобного рода исследований для развития потенциального лекарственного средства неоднократно описана ранее [2, 3].

Цель исследования

Изучение острой и хронической токсичности ГК-2.

Материалы и методы

Исследуемый препарат. В эксперименте использовали готовую лекарственную форму ГК-2 (серия 2050117, произведена в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку- сова»). В 1 мл готовой лекарственной формы (ГЛФ) было: ГК-2 (лиофилизата) – 0,001 г; сахарозы – 0,020 г; полиэтиленгликоля 4000 – 0,060 г. Для унификации расчётов 1 мл ГЛФ приравнивали к 1 г ГЛФ. В качестве контроля использовали стерильный физиологический раствор NaCl (серия 45) и плацебо (серия 2030117) в составе (на 1 мл): сахарозы – 0,020 г; полиэтиленгликоля 4000 – 0,060 г.

При изучении острой токсичности ГЛФ ГК-2 вводили однократно в дозах, вызывающих гибель части или всех животных в группе. Инъекции ГК-2 осуществляли внутривенно (в латеральную хвостовую вену: мышам – в дозе 11,4 г/кг, крысам – в дозе 9 г/кг). В отсутствии летальности, как произошло в эксперименте при внутривенном пути введения, ГК-2 применяли в предельно допустимых для введения животным объёмах: мышам – 0,5 мл, крысам – 2 мл [2]. Внутрибрюшинно мышам вводили ГК-2 в дозах 12; 15; 16,5; 18 и 21 г/кг, крысам – в дозах 3, 6, 9 и 12 г/кг. За животными наблюдали в течение 14 сут. после введения [4].

При исследовании хронической токсичности ГК-2 вводили внутривенно, как это планируется в случае его клинического применения, крысам – в латеральную хвостовую вену, кроликам – в краевую ушную вену. Внутривенное введение ГЛФ ГК-2 осуществляли 1 раз в сутки в течение одного месяца в дозе, соответствующей терапевтической – 100 мг/кг (1 мг/кг по активному веществу) и превышающей её в десять раз – 1000 мг/кг (10 мг/кг по активному веществу).

Лабораторные животные. Изучение острой токсичности проводили на беспородных белых мышах обоего пола (n =120, начальная масса 18–20 г) и беспородных белых крысах обоего пола (n = 84, начальная масса 180–200 г).

Исследование хронической токсичности проводили на беспородных белых крысах обоего пола (n = 60, начальная масса 180–200 г) и кроликах породы шиншилла обоего пола (n = 48, начальная масса 2–2,5 кг).

Все экспериментальные животные были получены из сертифицированных питомников и содержались в виварии в соответствии с ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Работы с мышами, крысами и кроликами выполняли в соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными [5] на основе стандартных операционных процедур, принятых в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», соответствующих правилам Европейской Конвенции ETS 123.

Методы оценки возможного токсического действия. Непосредственно после однократного внутривенного и внутрибрюшинного введения за животными, находящимися в индивидуальных пластиковых камерах, вели непрерывное наблюдение. Оценивали динамику гибели и изменение поведения. Павших животных вскрывали, данные фиксировали в протоколе. Через 8 ч выживших животных перемещали в клетки для группового содержания. Ежедневно, в течение 14 сут. (утром и вечером) фиксировали отклонения во внешнем виде, общем клиническом состоянии, реакциях на внешние раздражители и динамику смертности [2–4]. В ходе эксперимента оценивали изменение массы тела животных, суточное потребление ими корма и воды, поведенческие реакции. На 15-е сутки после введения ГК-2, согласно общему протоколу [2], животных подвергали эвтаназии и проводили патологоанатомическое вскрытие.

В ходе исследования хронической токсичности ГК-2 оценивали его влияние на интегральные показатели: внешний вид, поведение и клинические симптомы интоксикации (ежедневно); а также динамику массы тела и потребление корма и воды у крыс (еженедельно). Регистрацию физиологических параметров проводили до начала эксперимента, через 24 ч (крысы 1-, 2-, 3- и 4-й групп и кролики 1–3-й группы) и через 2 нед. после заключительного введения ГК-2. Влияние на сердечно-сосудистую систему определяли по показателям электрокардиографии и артериального давления. Изучение поведенческих реакций у крыс проводили по тесту «Открытое поле». Для определения возможных токсических эффектов, их обратимости и поиска органов-мишеней проводили гематологические, биохимические и патоморфологические исследования [6–8]. Оценивали возможное местное раздражающее действие ГК-2 при его внутривенном введении. Объём исследований был определён общим протоколом [2]. Все данные, полученные при исследовании экспериментальных животных, сравнивали с таковыми контрольных животных, получавших в тех же условиях раствор натрия хлорида 0,9 % изотонического и плацебо. Общая продолжительность наблюдения за экспериментальными животными при оценке хронической токсичности составила 30 сут. (1-, 2-, 3- и 5-й группы крыс, 1-, 2-й и 3-й группы кроликов) и 45 сут. (4-я «отставленная» группа крыс).

Методы статистической обработки. В экспериментах по оценке острой токсичности и расчёте среднесмертельных доз ГЛФ ГК-2 использовали метод Литчфилда и Уилкоксона [4]. Статистическая обработка результатов осуществлялась согласно общему протоколу исследований [2]. Все регистрируемые характеристики животных до и после исследования представлены в таблицах в виде частотных и/или процентных показателей или при помощи среднего, стандартного отклонения, медианы, верхней (75 %) и нижней квартилей (25 %), в зависимости от типа переменной. При оценке независимых выборок животных использовали критерий αχ2 (для частотных показателей), однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для непрерывных показателей с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. При невозможности использования ANOVA применяли непараметрический аналог дисперсионного анализа по Краскелу–Уоллису с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну. Результаты считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты

При однократном внутривенном введении ГЛФ ГК-2 беспородным белым мышам (в дозе 11,4 г/кг) и крысам (в дозе 9 г/кг) определение средней смертельной дозы не представлялось возможным из-за отсутствия гибели животных.

В ходе эксперимента у мышей и крыс, которым внутривенно однократно вводили ГЛФ ГК-2, развивалась сходная клиническая картина. Во время введения препарата («на конце иглы») у животных отмечали тонические судороги и рефлекс Штрауба. Первые 2–7 мин после введения препарата животные лежали на животе, вытянув задние лапы. В этот же период у них регистрировали тремор и нарушение координации движений. Дыхание у большинства животных было частым и поверхностным. Кожные покровы и видимые слизистые оболочки были бледными, склеры глаз замутнёнными. Затем активность животных восстанавливалась, у них наблюдался груминг. Реакция на внешние раздражители соответствовали норме. Не было отмечено нарушений ушного и корнеального рефлексов. В дальнейший период наблюдения за животными у них отмечалось чередование активного перемещения в индивидуальных камерах с состоянием покоя. Через 8 ч после однократного внутривенного введения ГЛФ ГК-2 двигательная активность животных полностью восстанавливалась. На следующие сутки после внутривенного введения животные были гиперактивны, у них регистрировали кратковременный тремор и повышенную чувствительность на звуковые раздражители (вздрагивали и вокализировали). При движении животные расставляли задние лапы и держали хвосты горизонтально поверхности пола. Постепенно, через 3–4 сут., наблюдаемые клинические признаки токсического действия препарата нивелировались и в дальнейшем не было зарегистрировано ни одного случая гибели животных и не отмечено выраженных признаков интоксикации. Дыхание, сердечно-сосудистая деятельность, состояние шерстного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек, реакция на внешние раздражители соответствовали норме.

При внутрибрюшинном введении была отмечена гибель мышей и крыс. Были произведены расчёты среднесмертельных доз для беспородных белых мышей и крыс. LD50 для самок беспородных белых мышей составила 15,4 (14,5 –16,4) г/кг, самцов – 15,7 (14,6–16,9) г/кг. Для самок и самцов беспородных белых крыс LD50 составила 6,9 (4,5–10,6) г/кг.

В ходе эксперимента у животных, однократно внутрибрюшинно получавших ГЛФ ГК-2, развивалась сходная клиническая картина. Большинство животных сразу после инъекции пытались дотянуться до места прокола и вылизать его. Почти сразу после введения препарата у животных отмечалось снижение двигательной активности. Через 5–10 мин состояние животных продолжало ухудшаться: во всех экспериментальных группах регистрировался тремор. При введении ГК-2 в высоких дозах регистрировали приступы клонических судорог, которые длились от 10 до 30 с. Дыхание было частым, поверхностным. Видимые слизистые и кожные покровы были бледными. Гибель животных наступала через 40 мин – 1,5 ч после непродолжительного приступа (1–3 мин) клонических судорог. Когда через 8 ч выживших животных перемещали в клетки группового содержания, у них фиксировали тремор различной степени выраженности и нарушение координации движения (динамическую атаксию). Хвосты у большинства животных были приподняты и параллельны полу. При движении животные высоко приподнимались на лапах, чтобы не касаться животом пола. Гибель животных отмечалась в первые трое, а у крыс в первые пять суток. Выжившие животные в течение первой недели были малоподвижны, у большинства отмечались тремор и нарушение координации движений. В это время реакция на внешние раздражители была повышенной, животные выпрыгивали из клеток, вокализировали и были агрессивны. В дальнейшем, на 7–10-е сутки после введения ГК-2, состояние и поведение животных нормализовалось и не отличалось от такового у контрольных животных.

Патологоанатомическое исследование, проведённое в ходе изучения острой токсичности ГК-2 при его внутрибрюшинном введении, позволило выявить у павших животных нарушения водно-солевого гомеостаза, а также ярко выраженные признаки расстройства кровообращения. У животных, павших на ранних сроках, в брюшной полости была обнаружена жидкость (у мышей в объёме 2–3 мл, у крыс в объёме 5–7 мл) от соломенно-жёлтого до розового цвета. У животных, павших в более поздние сроки, жидкость в брюшной полости, как правило, отсутствовала, а жир сальника и брыжейки выглядел, как гирлянда из сухих светло-жёлтых шариков. Спаек не было. Сосуды органов брюшной и тазовой полостей, а также сосуды брыжейки у животных, павших в ранние сроки эксперимента, были сильно кровенаполнены. На поверхности кишечника обнаруживались точечные кровоизлияния. С другой стороны, инъекция сосудов органов брюшной и тазовой полостей, а также сосудов брыжейки у мышей, павших в более поздние сроки эксперимента, была не столь заметной.

Патологоанатомическое исследование мышей и крыс, выживших и выведенных из эксперимента спустя 14 сут. после однократного внутривенного и внутрибрюшинного введения ГК-2, позволило установить, что морфологическая картина их внутренних органов не отличалась от таковой, наблюдаемой у контрольных животных.

Исследование хронической токсичности позволило установить, что ГК-2 в дозах 1 и 10 мг/кг (по активному веществу) при ежедневном внутривенном введении беспородным белым крысам и кроликам в течение одного месяца не вызывает изменений их общего состояния и внешнего вида, а также выраженных изменений массы тела экспериментальных животных. Исключение составили самки крыс экспериментальных групп, у которых наблюдали снижение показателей прироста массы тела (табл. 1). Также у этих же животных фиксировали дозозависимое снижение потребления корма и воды (табл. 2).

При хроническом внутривенном введении ГК-2 не вызывает выраженных изменений поведения экспериментальных животных в тесте «открытое поле», патологических изменений в показателях электрокардиограммы во втором стандартном отведении, и не влияет на артериальное давление и ректальную температуру животных. Не отмечено негативного влияния ГК-2 на систему крови экспериментальных животных, биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных и физико-химические свойства мочи у крыс.

В результате проведённого патологоанатомического вскрытия установлено, что ежедневное внутривенное введение ГЛФ ГК-2 в дозах 1 и 10 мг/кг в течение одного месяца не вызывает закономерных изменений морфологической картины внутренних органов беспородных белых крыс обоего пола и кроликов породы шиншилла обоего пола.

Микроскопическая картина всех изученных внутренних органов и головного мозга беспородных белых крыс, выведенных из эксперимента через 24 ч или 14 сут. (крысы «отставленной» группы) после заключительного внутривенного введения ГЛФ ГК-2 в дозах 1 и 10 мг/кг, была аналогична таковой, наблюдаемой у крыс контрольной группы, получавших внутривенно раствор натрия хлорида 0,9 % изотонического или плацебо.

Микроскопическая картина всех изученных внутренних органов кроликов породы шиншилла, выведенных из эксперимента спустя 24 ч после заключительного внутривенного введения ГЛФ ГК-2 в дозах 1 и 10 мг/кг, была аналогична картине, наблюдаемой у кроликов контрольной группы, получавших внутривенно раствор натрия хлорида 0,9 % изотонического, и у кроликов, получавших внутривенно плацебо.

При оценке местного раздражающего действия под кожей в области боковых хвостовых вен большинства крыс были обнаружены кровоизлияния различной величины – от мелких до средних и разлитых. У большинства кроликов под кожей в области краевых ушных вен были обнаружены небольшие кровоизлияния.

При микроскопическом изучении участков, прилежащих к местам внутривенных инъекций препарата ГК-2 в дозах 1 и 10 мг/кг, установлено, что их микроскопическая картина является идентичной таковой, наблюдаемой у контрольных животных, а также животных, которым в аналогичных условиях вводили плацебо. Эта картина характеризуется неизбежной реакцией на механическое повреждение вен и окружающих тканей в виде полнокровия, кровоизлияний, околососудистого отёка и умеренной инфильтрации полиморфноядерными лейкоцитами, лимфоцитами и макрофагами (рис. 1–3).

Заключение

Обобщая результаты оценки острой токсичности, следует констатировать, что при однократном внутривенном и/или внутрибрюшинном введении ГЛФ ГК-2 является относительно безвредным и, по классификации Сидорова К.К. (1973 г.), может быть отнесён к 6-му классу токсичности.

При исследовании хронической токсичности ГЛФ ГК-2, которое было выполнено в соответствии с протоколом, установленным Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [2, 3], не было выявлено токсических эффектов и местного раздражающего действия.

Проведённые исследования не установили данных, препятствующих дальнейшей разработке лекарственного кандидата ГЛФ ГК-2.

Литература / References

1.       Антипова Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Исследование in vitro нейропротективных свойств нового оригинального миметика фактора роста нервов ГК-2 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150. – № 11. – С. 538–541. [Antipova TA, Gudasheva TA, Seredenin SB. In vitro study of neuroprotective properties of GK-2, a new original nerve growth factor mimetic. Byulleten Eksperimentalnoy Biologii i Meditsiny. 2010; 150 (11): 537–540 (In Russ).]

2.       Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств. Изучение острой токсичности. Изучение хронической токсичности. – М.: Гриф и К; 2012. – С. 15–19. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. CH. 1. Metodicheskie rekomendacii po izucheniyu obshchetoksicheskogo dejstviya lekarstvennyh sredstv. Izuchenie ostroj toksichnosti. Izuchenie hronicheskoj toksichnosti. Moscow: Grif i K; 2012.

(In Russ).]

3.       Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. Изучение «острой» токсичности. Изучение «хронической» токсичности. – М.:     Медицина; 2005. – С. 41–54. [Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novyh farmakologicheskih veshchestv. Metodicheskie ukazaniya po izucheniyu obshchetoksicheskogo dejstviya farmakologicheskih veshchestv. Izuchenie «ostroj» toksichnosti. Izuchenie «hronicheskoj» toksichnosti. Moscow: Medicine; 2005. (In Russ).]

4.       Беленький М.Б. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. – Л.: Медгиз; 1963. [Belen'kij MB. Elementy kolichestvennoj ocenki farmakologicheskogo effekta. Leningrad: Medgiz; 1963. (In Russ).]

5.       Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academies Press (US). Washington (DC). 2011. DOI: 10.17226/12910

6.       Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. 5-е изд., испр. и доп. – Л.: Медицина; Ленингр. отд-ние. 1969. [Merkulov GA. Kurs patologogistologicheskoi tekhniki. Leningrad: Medicine; 1969. (In Russ).]

7.       Микроскопическаятехника. Руководство для врачей и лаборантов / под ред. Саркисова Д.С. и Перова Ю.Л. – М.: Медицина; 1996 [Mikroskopicheskaya tekhnika. Rukovodstvo dlya vrachei i laborantov. Ed by Sarkisov DS, Perov YuL. Moscow. Medicine; 1996. (In Russ).]

8.       Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника: Руководство. – Смоленск: САУ; 2000. [Sapozhnikov AG, Dorosevich AE. Gistologicheskaya i mikroskopicheskaya tekhnika: Rukovodstvo. Smolensk: SAU; 2000. (In Russ).]

Похожие статьи