Изучение особенностей проницаемости гемато-энцефалического барьера для новых нейротропных пептидных лекарственных препаратов
Ср, 26 Июнь 2019
300

Резюме. В работе представлены результаты исследований особенностей проникания через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) крыс трёх новых пептидных лекарственных препаратов — модифицированных аналогов эндогенных нейропептидов и их активных метаболитов, созданных в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Обсуждаются основные физико-химические характеристики дипептидных препаратов, позволяющие прогнозировать проникание изучаемых соединений через ГЭБ. Все три изучаемые соединения: ноопепт — пептидный аналог пирацетама (этиловый эфир N-фенил-ацетил-L-пролил-L-глицин) с ноотропной и нейропротективной активностью, дилепт — аналог нейротензина (метиловый эфир N-капроил-L-пролил-L-тирозина) – антипсихотик с положительным когнитивнотропным эффектом и соединение ГБ-115 (амид N-гексаноил–L-глицил-L-триптофана) – ретроаналог холецистокинина-4 — селективный анксиолитик. С использованием метода ВЭЖХ-МС/МС показано, что ноопепт и его активный метаболит цикло-пролил-глицин (ЦПГ) обнаруживаются в мозге крыс после перорального введения ноопепта, что указывает на их проникание через ГЭБ с коэффициентами Кмозг/плазма 1,61 и 1,36 соответственно; дилепт и его активный метаболит М1 проникают через ГЭБ с разными коэффициентами Кмозг/плазма, составляющими для дилепта 2,0 и метаболита — 0,5, что может указывать на различные механизмы транспорта этих соединений в ЦНС. Показано, что анксиолитик ГБ-115 также проникает через ГЭБ с высоким коэффициентом Кмозг/плазма — 1,41. Таким образом, все три дипептидных аналога природных нейропептидов проникают через ГЭБ, имеют высокую тропность к ткани мозга крыс, что может свидетельствовать об их возможном прямом влиянии на структуры мозга, принимающие участие в реализации фармакологических эффектов этих препаратов.

The study of the permeability of the blood-brain barrier for new neurotropic peptide drugs

Resume. The paper presents the results of studies of penetration through the hemato-encephalic barrier (BBB) of rats of three new peptide drugs – modified analogues of endogenous neuropeptides and their active metabolites created in the research Zakusov institute of Pharmacology. Discussed the main physical-chemical characteristics of study dipeptides which allow predicting the penetration of peptide compounds through the BBB. All three of the studied compounds: noopept is a peptide analog of piracetam (ethyl ether N-phenylacetyl-L-prolyl-L-glycine) with nootropic and neuroprotective activity, dilept – analoge of neurotensin (methyl ether of N-caproyl-L-prolyl-L-tyrosine) – antipsychotic wich positive mnemotropic effect and the compound GB-115 (amide N-hexanoyl–L-glycyl-L-tryptophan) – retroanaloge of cholecystokinin-4 is a selective anxiolytic with anti-alcohol effect. In experiments on rats using the method of HPLC-MS/MS was shown that noopept and its metabolite cyclo-prolyl-L-glycine (CPG) are found in brain of rats after oral administration of the substance drugs, which indicates their penetration through the BBB with coefficients Kbrain/plasma 1.61 and 1.38, respectively; Dilept and its active metabolite M1, are detected in the brain of rats, which indicates the penetration of both compounds through the BBB with the coefficients the brain/plasma for dilept 2.0 and metabolite-0.5, that indicated on different mechanism of transport these compounds trough the BBB. It is shown that the anxiolytic GB-115 also penetrates through the BBB with a high coefficient Kbrain/plasma — 1.41. Thus, all three dipeptide analogues of natural neuropeptides penetrate the BBB, have a high tropicity to the brain tissue of rats, which may indicate their direct influence on the brain structures involved in the realization of pharmacological effects of these drugs.

Введение

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» на основе аналогов природных нейропептидов разработаны три дипептидных препарата: ноопепт — этиловый эфир фенил-ацетил-L-пролил-L-глицин, являющийся пептидным аналогом пирацетама и вазопрессина, с 2006 года внедрён в медицинскую практику в качестве ноотропного средства, препарат дилепт — метиловый эфир капроноил-L-пролил-L-тирозина — аналог природного антипсихотика нейротензина с положительным мнемотропным действием прошел стадии доклинического и клинического изучения, в настоящее время решается вопрос о его внедрении в медицинскую практику. Третий препарат — соединение ГБ-115 — гексаноил-L-глицил-L-триптофан амид, являющийся ретроаналогом холецистокинина-4, также прошёл стадии доклинического и клинического изучения, разработана новая технология его таблеточной лекарственной формы на основе микронизированной субстанции с улучшенными фармакокинетическими характеристиками — энзиматической устойчивостью и большей величиной тканевой биодоступности. В настоящее время также рассматривается вопрос о его внедрении в клиническую практику для лечения тревожных состояний, фобий и других патологических состояний.

Экспериментальная часть

Проницаемость ГЭБ для новых нейротропных пептидных препаратов

Изучение фармакокинетики новых лекарственных препаратов является необходимым этапом для их внедрения и эффективного и безопасного применения в клинике [1]. Особое значение это направление исследований имеет для пептидных лекарственных препаратов в связи с их энзиматической нестабильностью и образованием метаболитов, обладающих собственной фармакологической активностью. Кроме того, эффективность фармакотерапии зависит от доставки лекарственных веществ (ЛВ) в орган-мишень — мозг, которая определяется его способностью проникать через ГЭБ. ГЭБ осуществляет барьерную функцию, ограничивающую проникание фармакологически активных ЛВ в концентрациях, превышающих эффективные, и способствует сохранению гомеостаза. Экспериментальные данные о проницаемости пептидных ЛВ через ГЭБ могут иметь значение для выяснения механизма действия и их роли в проявлении фармакологических эффектов изучаемых лекарственных препаратов (ЛП). В данной работе приводятся результаты исследования особенностей проникания изучаемых препаратов через гематоэнцефалический барьер в ЦНС (мозг крыс), которые оценивали по соотношению их площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге и плазме крови крыс, характеризующее тканевую биодоступность к мозгу крыс, и выражали в виде коэффициента Кмозг/плазма.

Ноопепт

На основе структурной формулы молекулы ноопепта были рассчитаны его основные физико-химические характеристики, а также его метаболита — ЦПГ, позволяющие прогнозировать проникание изучаемых соединений через ГЭБ. В соответствии с «правилом пяти», предложенному LipinskiCА [2], ЛВ имеет хорошую абсорбцию, если его молекулярная масса менее 500 а. е. м., коэффициент распределения октанол/вода log/Р менее 5, число доноров водородной связи, выраженной суммой OHи NН-, менее 5, число акцепторов водородной связи, выраженной количеством Nи O-атомов, менее 10. Молекулярный вес ноопепта 318 а. е. м., значение коэффициента распределения в системе октанол-вода — 2,51, число доноров водородной связи 2, число акцепторов водородной связи – 3. Молекулярная масса ЦПГ составляет 154 а. е. м., коэффициент распределения октанол/вода log/Р равен 2,05, число доноров водородной связи — 2, число акцепторов водородной связи равно 2. Таким образом, ноопепт и его активный метаболит ЦПГ удовлетворяют используемому методу Lipinski «правилу пяти» и теоретически возможно их проникание через ГЭБ.

Целью наших исследований стало экспериментальное изучение проникания исследуемых соединений через ГЭБ крыс.

При изучении фармакокинетики ноопепта было установлено, что препарат быстро метаболизируется в организме крыс с образованием активного метаболита циклической структуры — цикло-пролил-L-глицин (ЦПГ), который определяется в плазме крови крыс в более высокой концентрации и значительно более продолжительное время — в течение 4–6 ч после введения по сравнению с ноопептом, период полувыведения которого составлял 25–30 мин после перорального введения субстанции препарата [3, 4]. В результате пресистемной элиминации ноопепта происходит отщепление фенилацетильного радикала от молекулы ноопепта с образованием пролил-глицина, который превращается в циклическую форму — ЦПГ. ЦПГ был впервые обнаружен нами в плазме и мозге крыс с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС, установлена его структура, изучена его фармакокинетика и рассчитаны основные фармакокинетические параметры в плазме крови и мозге крыс в сравнении с аналогичными параметрами ноопепта после перорального введения субстанции препарата [3–6]. Рассчитанные фармакокинетические параметры ноопепта и ЦПГ представлены в табл. 1.

Из представленных в таблице фармакокинетических параметров ноопепта и его метаболита ЦПГ в плазме крови и мозге крыс видно, что величины максимальных концентраций и площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге крыс как неизмененного препарата, так и его метаболита значительно превышают аналогичные параметры в плазме крови крыс. Полученные данные указывают на проникание через ГЭБ обоих соединений с высоким коэффициентом распределения, рассчитанными по соотношению площадей под фармакокинетическими кривыми, составляющими для ноопепта Кмозг/плазма — 1,61 и для ЦПГ — 1,38, что свидетельствует о высокой тропности ноопепта и его активного метаболита к ткани мозга крыс. Этот факт обусловлен близкими физико-химическими свойствами: небольшим молекулярным весом, количеством донорных и акцепторных связей обоих соединений, но в силу меньшей полярности, большей липофильности и лучшей растворимости в органических растворителях ноопепт проникает в мозг в большей степени, чем ЦПГ. Кроме того, можно отметить незначительные различия параметров, характеризующих элиминацию в мозге и плазме крови крыс для ноопепта; в то время как ЦПГ более длительное время циркулирует как в плазме, так и в мозге крыс по сравнению с ноопептом, на что указывает значительное увеличение его периода полувыведения, а также величины MRT. Более продолжительный период полувыведения ЦПГ, очевидно, связан с его циклической структурой и меньшей протеазной активностью ткани мозга по сравнению с её активностью в плазме крови крыс [4, 5]. Полученные результаты совпадают с литературными данными о большей стабильности циклических структур известных дипептидов по сравнению с их линейными структурами [7]. Структурный фрагмент ноопепта – пролил-глицин образует циклическую форму, которая более длительное время сохраняется в неизмененном виде, что выгодно отличает его от ноопепта.

Кроме того, следует отметить, что ноопепт, являющийся пептидным аналогом пирацетама, значительно превосходит по проницаемости через ГЭБ и тропности к мозговой ткани крыс пирацетам, который проникает через ГЭБ медленнее – максимальная концентрация у крыс после введения внутрь достигается через 2 часа и в этот период устанавливается максимальный коэффициент Кмозг/плазма, который составляет 0,996 [8].

Дилепт

Дилепт является аналогом нейротензина, который не проникает через ГЭБ и проявляет свою активность только при непосредственном введении в мозг. На основе нейротензина и атипичного нейролептика сульпирида создан его аналог, который проявляет фармакологическую активность не только при внутрисосудистом, но, что наиболее важно, при пероральном введении в дозах 0,4–4,0 мг/кг и 4,0–8,0 мг/кг соответственно. Отличительной чертой от известных нейролептиков является его особенность улучшать когнитивные функции и нейропротективное действие [9].

При изучении метаболизма дилепта у крыс было показано, что он подвергается интенсивной пресистемной элиминации с образованием 2 деэстерифицированных продуктов — М1 (N-капроил-L-пролил-L-тирозин) и М2 (N-капроил-Lпролин). При этом показано, что М1обладает собственной фармакологической активностью[10]. На основе структурной формулы молекулы дилепта были рассчитаны основные физико-химические характеристики дилепта и его метаболита, позволяющие прогнозировать хорошую абсорбцию и проницаемость через ГЭБ изучаемых соединений. Молекулярный вес дилепта — 390 а. е. м., значение коэффициента распределения в системе октанол-вода — 2,51, число доноров водородной связи 2, число акцепторов водородной связи — 7. Таким образом, дилепт удовлетворяет описанному ранее методу Lipinski и теоретически может проникать через ГЭБ путём свободной диффузии в физиологических концентрациях. Молекула метаболита дилепта имеет близкие параметры: молекулярный вес — 376 а. е. м., сумма акцепторов водородной связи также, как у дилепта, равна 7, число доноров водородной связи равно 3 и log Р составляет 2,36, но в то же время она более полярная по сравнению с молекулой дилепта, что может влиять на её транспорт через ГЭБ. В связи с быстрой и интенсивной пресистемной элиминацией дилепта у крыс после перорального введения его субстанции, под влиянием энзиматических систем ЖКТ (эстераз и пептидаз) и его предельно низких концентраций в плазме крови у этого вида животных, особенно на терминальном участке фармакокинетической кривой, на основании которого рассчитывается константа элиминации и период полувыведения — параметров, влияющих на величину площади под фармакокинетической кривой, доза препарата была увеличена от 40 мг/кг до 200 мг/кг; при этом, однако, дозовой зависимости «доза-концентрация» неизмененного препарата не наблюдалось, а концентрации образующихся метаболитов (особенно М1) многократно превосходили уровень концентраций неизмененного препарата. Учитывая вышеизложенное, при проведении экспериментов по изучению проникновения дилепта и его активного метаболита М1 через ГЭБ определяли одновременно содержание изучаемых соединений в мозге и плазме крови крыс через 15 мин после введения — времени достижения максимальной концентрации дилепта и метаболита в 2 дозах — 40 и 200 мг/кг. В связи с тем, что не было выявлено дозовой зависимости содержания в плазме и мозге крыс как для дилепта, так и для метаболита, целесообразно привести данные, полученные после введения дилепта в максимальной дозе и через один интервал времени — 15 мин после введения — времени достижения максимальной концентрации изучаемых соединений (табл. 2).

Из представленных в таблице данных видно, что дилепт и его активный метаболит определяются в ткани мозга крыс через 15 мин после перорального введения дилепта, что свидетельствует о проницаемости ГЭБ для этих молекул; при этом коэффициент распределения Кмозг/плазма для дилепта выше и, в среднем, составляет 2,0, а для активного метаболита – 0,5. Отсутствие зависимости «доза-концентрация» можно объяснить разным механизмом транспорта дилепта и его метаболита через ГЭБ. Большое значение коэффициента распределения дилепта между мозгом и плазмой крови крыс указывает на то, что его транспорт может быть реализован по механизму свободной диффузии; проникание же метаболита через ГЭБ, по всей вероятности, осуществляется с участием специфических пептидных переносчиков РеРТ-2, связывание которых с субстратом ограничено [11, 12]. Меньшая величина коэффициента проницаемости ГЭБ для активного метаболита М1, по сравнению с аналогичной величиной этого коэффициента для дилепта, связана с его высокой концентрацией в плазме крови крыс и большей полярностью, вследствие этого ГЭБ осуществляет защитную функцию в отношении мозга, ограничивая поступление в мозг высоких концентраций активного метаболита, что может сопровождаться нежелательными последствиями как со стороны его фармакологического эффекта, так и токсикологического действия. Известно ограничивающее влияние ГЭБ на проникание высоких концентраций гормонов, медиаторов и психоактивных веществ в мозг для предотвращения их нежелательных токсических эффектов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различной проницаемости ГЭБ для дилепта и его активного метаболита и предотвращении проникания в мозг высоких концентраций активного метаболита. В то же время полученные данные свидетельствуют о проникании дилепта и метаболита М1 в мозг, с чем может быть связано проявление его центральных эффектов.

Селективный анксиолитик ГБ-115

В соответствии с «правилом пяти» [2], предварительно были рассчитаны физико-химические показатели соединения ГБ-115, являющегося амидом N-фенил-N-гексаноил-Lглицил-L-триптофана, с целью прогнозирования возможности его проникания через ГЭБ. Молекулярная масса соединения ГБ-115 равна 434,52; число доноров водородной связи — 2; акцепторов —3; растворимость в системе октанолвода — 3,15, в соответствии с полученными данными изучаемый дипептид теоретически может проникать через ГЭБ.

Целью данного фрагмента работы было экспериментальное подтверждение проницаемости ГЭБ крыс для анксиолитика ГБ-115.

На основе полученных экспериментальных данных [13] рассчитаны основные фармакокинетические параметры анксиолитика в плазме крови и мозге крыс, которые представлены в табл. 3.

Из представленных в таблице данных видно, что анксиолитик быстро (в течение 0,75 ± 0,25 ч) и интенсивно проникает через ГЭБ в мозг крыс, на что указывает величина его Сmax в ткани мозга, которая на 19 % выше по сравнению с величиной этого параметра в плазме крови, а также значительно больше величина площади под фармакокинетической кривой. По соотношению величин площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге и плазме крови крыс было установлено, что соединение ГБ-115 проникает через ГЭБ в мозг с коэффициентом распределения Кмозг/плазма — 1,45, что свидетельствует о высокой тропности анксиолитика к ткани мозга и его возможном непосредственном влиянии на внутриклеточные структуры мозга экспериментальных животных, связанные с проявлением его анксиолитического эффекта. Параметры, характеризующие процесс элиминации дипептида из мозга и плазмы крови крыс имеют близкие значения, за исключением параметра MRT, который в мозге выше, чем в плазме, что может указывать на связывание анксиолитика с клеточными структурами ткани мозга крыс и не исключает возможности его непосредственного влияния на структуры, связанные с реализацией анксиолитического действия изучаемого дипептида.

Заключение

В результате проведённых исследований установлено, что все 3 изучаемые дипептидные соединения с нейротропной активностью, представляющие собой модифицированные аналоги природных нейропептидов — ноотропный препарат ноопепт и его активный метаболит ЦПГ, антипсихотик с позитивным когнитотропным действием дилепт и селективный анксиолитик ГБ-115 обнаруживают высокую тропность к ткани мозга крыс и проникают через ГЭБ с высокими коэффициентами распределения Кмозг/плазма, что может указывать на их непосредственное влияние на центральную нервную систему и формирование фармакологических эффектов этих соединений. В то же время для дилепта и его активного метаболита показаны отличительные особенности проникания через ГЭБ, а именно, отсутствие дозовой зависимости и меньшей величины коэффициента Кмозг/плазма для метаболита по сравнению с неизмененным препаратом, что может указывать на разный механизм транспорта этих соединений через ГЭБ: для дилепта — посредством пассивной диффузии, а для метаболита — с участием системы активных переносчиков, число которых ограничено, и защитную роль ГЭБ от проникания в мозг высоких концентраций активного продукта метаболизма дилепта.

Выводы

1.               Установлено, что изучаемые дипептидные аналоги природных нейропептидов проникают через ГЭБ, имеют высокую тропность к ткани мозга крыс, что может свидетельствовать об их непосредственном влиянии на нейромедиаторные системы мозга, принимающие участие в реализации фармакологических эффектов этих препаратов.

2.               Показано для дилепта и его активного метаболита отсутствие дозовой зависимости проникания этих соединений в мозг крыс, что, возможно, связано с большой дозой дилепта, высокими концентрациями образующегося активного метаболита, а также различным механизмом транспорта этих соединений через ГЭБ.

Литература / References

1.               Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. Миронова А.Н. – М.: Гриф и К.; 2012. [Rukovodstvopoprovedeniyudoklinicheskihissledovanijlekarstvennyhsredstv. Ed by Mironov AN. Moscow: Grif i K; 2012. (In Russ).]

2.               Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ. Experimental and computational approach to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. 1997;23(1-3):3–25.

3.               Boiko SS, Ostrovskaya RU, Zherdev VP, et al. Pharmacokinetics of new nootropic acylprolyldipeptide and its penetration across the blood-brain barrier after oral administration. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2000;129(4):359–361. DOI: https://doi.org/10.1007/BF02439270.

4.               Boiko SS, Zherdev VP, Gudasheva TA, et al. Pharmacokinetics of the new potential dipeptide nootrope GVS-111 and related metabolites in rat brain. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2001; 35(9):474–476. DOI: 10.1023/A:1014082406443.

5.               Gudasheva ТA, Boyko SS, Akparov VKh, et al. Identification of a novel endogenous memory facilitating cyclic dipeptide cyclo-prolylglycine in rat brain. FEBS Lett. 1996;391(1-2):149–152.

6.               Gudasheva TA, Boyko SS, Ostrovskaya RU, et al. The major metabolite of dipeptide piracetam analogue GVS-111 in rat brain and similarlity to endogenous neuropeptide cycloprolylglyzine. Europ. J. Drug Metabol. and Pharmacokin. 1997;22(3):245–252. DOI: https://doi.org/10.1007/ BF03189814.

7.               Prasad C. Bioactive cyclic dipeptides. Peptides. 1995;16(1):151–164. DOI: https://doi.org/10.1016/0196-9781(94)00017-Z.

8.               Van Hoff H, editor. Nootropil. 4-th ed. Brussels: UCB Pharmaceutical Division; 1980.

9 Островская Р.У., Ретюнская М.В., Гузеватых Л.С., и др. Трипептоидный аналог нейротензина дилепт сочетает нейролептическую активность с положительным мнемотропным действием // Эксп. и клин. фармакол. 2005;68(1):3–6. [Ostrovskaya RU, Retyunskaya MV, Guzevatykh LS, et al. Dilept: a tripeptoid neurotensin analog combining neuroleptic activity with positive mnemotropic action. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2005;68(1):3–6. (In Russ).]

10.             Горелов П.И., Островская Р.У., Сазонова Н.М. Оценка прокогнитивного эффекта дилепта и его основного метаболита, ГЗР-125, в тесте распознавания объектов у крыс // Эксп. и клин. фармакол. 2013;76(7):3–5. [Gorelov PI, Ostrovskaya RU, Sazonova NM. The Study of Procognitive Effect of the Potential Antipsychotic, Dilept and Its Main Metabolite, GZR-125 at the Novel Objects Recognition Test in Rats. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2013;76(7):3–5. (In Russ).] DOI: https://doi.org/10.30906/0869-2092-2013-76-7-3-5.

11.             Жердев В.П., Бойко С.С., Месонжник Н.В, и др. Экспериментальная фармакокинетика препарата дилепт // Эксп. и клин. фармакол. 2009;72(3):16–21. [Zherdev VP, Boiko SS, Mesonzhnik NV, et al. Experimental pharmacokinetics of the new neurotensine-derived antipsychotic drug dilept. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2009;72(3):16–21. (In Russ).] DOI: https://doi.org/10.30906/0869-2092-2009-72-3-16-21.

12.             Ganapathy ME, Prasad PD, Mackenzie B, et al. Interaction of anionic cephalosporins with the intestinal and renal peptide transporters PEPT 1 and PEPT 2. Biochem. Biophis. Acta. 1997;1324(2) 296–308. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0005-2736(96)00234-9.

13.             Бойко С.С., Колыванов Г.Б., Жердев В.П., и др. Экспериментальное исследование фармакокинетики триптофансодержащего дипептида ГБ-115 // Бюлл.экспер. биол. и мед. 2007;144(9):285-288. [Boyko SS, Kolyvanov GB, Zherdev VP, et al. Experimental study of the pharmacokinetics of a tryptophan-containing dipeptide GB-115. Bulletin of experimental biology and medicine. 2007;144(9):285–-288. (In Russ).] DOI: https://doi.org/10.1007/s10517-007-0319-0.

Похожие статьи