Матюшкина М.В.1, Годован В.В.1, Сейфуллина И.И.2, Гридина Т.Л.3

1 — Кафедра общей и клинической фармакологии Одесского национального медицинского университета,  г. Одесса, Украина

2 — Одесский национальный университет им. И.И.  Мечникова, г. Одесса, Украина

3 — НИИ «Украинский научно-исследовательский противочумный институт им. И.И.  Мечникова» МЗ Украины

Резюме.  Изучены фармакологические свойства  нового  координационного соединения  — биологически  активного  вещества — кобальт бис(цитрато)станната. В результате  проведённых исследований  установлено, что соединение  проявляло  выраженную противовирусную активность в отношении вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (H3N2), А/PR/8/34 (H1N1) М и вируса гриппа птиц H5N3 на культуре ткани хорион-алантоисных оболочек (ХАО) 11-12 суточных куриных эмбрионов и монослойной культуре клеток MDCK. Соединение относится к малотоксичным (при внутрибрюшинном введении крысам LD50 = 206,63 мг/кг; пероральном — LD50 = 1836,76), что дает перспективу для дальнейшего его доклинического исследования как противовирусного средства.

Ключевые слова: координационное соединение, олово, кобальт, лимонная кислота, вирус гриппа.

Coordination compounds cobalt bis(citrate)stannate — are results of searching new antiinfluenza drugs

Matyushkina M.V.1, Godovan V.V.1, Seyfullina I.I.2, Grydina T.L.3

1 — Odessa State Medical University

2 — I.I. Mechnikov National University

3 — RI «Ukrainian Research Institute antiplague I.I. Mechnikov» Ministry of Health of Ukraine

1. Summary. The pharmacological properties of new coordination compound — the biologically active substance — cobalt bis(citrate) stannate was studied. The result of researching  are: the  compound has  antiviral activity against  human  influenza  virus strains  A/ Honghong/1/68 (H3N2), A/PR/8/34  (H1N1), and influenza virus H5N3 in tissue culture chorio-allantoic membranes (CAM) of chick embryos

11-12 daily and monolayer culture of MDCK cells used. Compound  has a low toxicity (by intraperitoneal injection LD50 = 206,63 mg/kg;

orally — LD50 = 1836,76), that gives perspective  to further his preclinical studies as an antiviral agent.

Keywords: coordination compound, tin, cobalt, citric acid, virus of influenza.

Автор, ответственный за переписку:

Матюшкина Марина Владимировна — аспирант, кафедра общей и клинической фармакологии Одесского национального  медицинского университета, г. Одесса, Украина; тел. (+38)050-416-64-62; e-mail: shemonayeva_56@mail.ru

Введение

По данным ВОЗ, грипп занимает первое место по частоте и количеству случаев в мире, что предопределяет социальное  и экономическое значение данной проблемы. По статистике гриппом ежегодно в мире заболевает до 500 млн.  человек  [1]. Смертность  вследствие  постгриппозных осложнений составляет  7,5-23 на 100 тыс. населения, причём большая часть этих смертей приходится на детей до 5 лет и людей старше 65 лет. Ежегодные эпидемии гриппа приводят к развитию или обострению имеющихся  в анамнезе  хронических  заболеваний  [2]. Естественно, что огромным является и экономический ущерб от эпидемий  гриппа.  Проблема  заболеваемости гриппом усугубляется еще и тем, что вспышки  и эпидемии гриппа прогнозируются  с трудом; вирусы гриппа А и В отличаются  чрезвычайной антигенной  изменчивостью, а наблюдающаяся реассортация  между штаммами вируса гриппа  А человека,  млекопитающих  и птиц увеличивает риск возникновения новых пандемических штаммов [3]. Кроме того, в течение 10-15 последних лет вирусы  гриппа  птиц  в  результате  мутаций изменили свои биологические свойства,  приобрели  возможность инфицировать людей и вызывать очень  тяжёлые  клинические  формы  заболевания, значительный  процент которых  заканчивается летально  [4]. Это  сказывается на эффективности вакцинации, рекомендованной ВОЗ в качестве основного средства борьбы против гриппа.

Другим способом  профилактики и лечения  гриппа является  фармакотерапевтическое воздействие, включающее средства этиотропной, иммунокорригирующей и симптоматической  терапии.   Среди приоритетной группы этиотропных  препаратов  ведущее место на сегодня занимают  те, которые оказывают прямое противовирусное действие. Однако арсенал противогриппозных средств на современном фармацевтическом рынке

В этом плане внимание исследователей привлекают металлокомплексы, ряд которых  обладает достаточно широким спектром  антибактериальной и противовирусной активности [7, 9, 10]. В частности, установлено, что металлокомплексы могут действовать на вирус различными  путями: инактивировать вирус, заняв  на его поверхности   активные   центры;  проникать через  липидную  оболочку  вируса;  препятствовать его размножению в клетке; разрушать вирус вне клетки [11, 12].невелик и представлен фактически  двумя группами: ингибиторы   нейраминидазы (осельтамивир, занамивир) и блокаторы М -каналов (амантадин, ремантадин). К сожалению,  эти препараты  не идеальны:  имеют достаточно широкий спектр противопоказаний и нежелательных эффектов, ограничения применения (возраст, беременность, лактация), быстрое возникновение фармакорезистентности, достаточно  высокая  стоимость  и другие [5, 6]. Можно выделить и третью группу противогриппозных препаратов,  которые  одновременно обладают противовирусной и иммуномодулирующей  активностью  (умифеновир, инозин  пранобекс, альтабор, интерфероны и другие) [7], но они  также не лишены недостатков  [8]. В связи  с вышеизложенным сегодня продолжается интенсивный поиск эффективных и безопасных противогриппозных средств.

Цель исследования

Цель данного исследования — это изучение противогриппозной активности нового биологически активного вещества (БАВ) — кобальт бис(цитрато)станната.

Материалы и методы

БАВ  —  кобальт   бис   (цитрат)   станната   формулы  [Co(H  O) ][Sn(НCitr) ]·4H O  (М  = 735,7  г/моль) синтезировано на  кафедре  общей  химии  и биополимеров Одесского национального  университета имени  И.И.  Мечникова под  руководством  заслуженного деятеля  науки  и техники  Украины,  проф. И.И.  Сей- фуллиной. По данным  рентгеноструктурного анализа (РСА),   соединение  построено   с центросимметрических  октаэдрических катионов  [Co(H  O)]^2- , анионов

В кристаллах комплексные катионы  и анионы объединены  непосредственно между собой  и через кристаллизационные молекулы  воды водородными связями  в трёхмерный  каркас  [13]. Структурная формула нового соединения представлена  на рис. 1.[Sn(НCitr) ]2-  и  кристаллизационных  молекул воды.

Рис. 1. Структурная формула кобальта бис(цитрато)станната

Изучение  безвредности  нового БАВ in vivo показало, что соединение относится  к малотоксичным веществам (IV класс) [14] — LD при внутрибрюшинном введении крысам составило 206,63 мг/кг; пероральном — 1836,76.

Однако перед изучением  специфического действия против  вирусов  гриппа  человека  и птиц  нового БАВ первоначально определяли   степень  цитотоксичности соединения на трех клеточных моделях.

По первой модели методика  проведения исследования заключалась в создании контакта водных растворов исследуемого   вещества   в  различных   концентрациях с тест-клетками — инфузориями Colpoda  steinii (ООО

«Возрождение М», Одесса, Украина) [15]. Это позволило определить  максимально переносимую концентрацию (МПК) соединения по показателям их жизнеспособности  через 3 ч после начала контакта и тем самым установить степень цитотоксичности БАВ. Вторая модель определения степени  цитотоксичности нового БАВ проведена стандартно на культуре ткани хорион-алантоисных оболочек  (ХАО) 11-14-суточных  куриных эмбрионов [16].  Третьей  моделью  с  использованием культуры клеток МDСК (культура клеток почки  собаки) определялась МПК исследуемого БАВ, которую рассчитывали, исходя из наибольшей концентрации соединения, не вызывавшей дегенерацию клеток [17].

Противогриппозную активность  БАВ изучали в отношении штаммов  вируса  гриппа  А/Гонконг/1/68 (H3N2)  и A/PR/8/34 (H1N1), а также  вируса  гриппа птиц  H5N3,  с использованием культуры  ткани  ХАО

11-12 суточных куриных эмбрионов [16]. Эта культура считается  наиболее  приближенной к  уровню целого организма, которым является  куриный  эмбрион. Кроме того, использование культуры ткани ХАО является более

экономичным методом по сравнению с использованием  куриных эмбрионов для определения противовирусного действия веществ [16].

Расчёт  lg TИД₅₀ (дозы,  которая  вызывает  инфицирования  50% и более фрагментов ткани ХАО) в экспериментах  in vitro проводили  по методу Кербера  Б.А. в модификации Ашмарина И.П. [18].

Оценки противовирусной активности соединения с  использованием метода  торможения развития  вирус-индуцированного цитопатического эффекта  проводили  на монослойной культуре клеток  MDCK, согласно общепринятой методики [17].

В качестве  референс-препарата  использовали Тамифлю  (осельтамивир), порошок для  приготовления суспензии  для приема внутрь по 12 мг в 1 мл во фл. по 30 мл фирмы  Хоффманн-Ля Рош (Швейцария) в концентрации 410 мкг/мл, что соответствует 1х10-3 Моль.

Статистическую значимость   антивирусной активности БАВ (р>0,05) определяли  по непараметрическому критерию знаков для связанных выборок (p по критерию знаков — К.З.) [19].

 Результаты и обсуждения

В результате проведённых  исследований выявлено, что МПК  кобальта  бис(цитрато)станната на культуре инфузорий Colpoda steinii, тканевой   культуре  ХАО и культуре клеток МDСК составила 7000, 7000 и 368 мкг/ мл,  соответственно.  Вследствие  полученных   данных по цитотоксичности нового БАВ, для определения его противогриппозной активности в отношении штамма вируса  гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2)   на  тканевой культуре ХАО были отобраны  следующие  дозы: 7000, 3500 и 735 мкг/мл, что соответствует  1,0х10-2,  0,5х10-3 и 1,0х10-3   Моль.  Результаты  исследований приведены в табл. 1.

Установлено, что новое  соединение в концентрации  7000 мкг/мл  полностью  подавляло  репродукцию штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2)  на тканевой  культуре ХАО по сравнению с контролем  (без применения БАВ), несколько даже превышая эффективность референс-препарата Тамифлю, который  в концентрации 410 мкг/мл  подавлял  репродукцию  вируса на 4,17 lg ТИД₅₀.

В концентрациях 3500 и 735 мкг/мл кобальт бис(цитрато)станнат  статистически достоверно относительно контроля   подавлял  репродукцию   вируса  гриппа  (на 2,50 и 1,75 lg ТИД₅₀), однако уступал по активности препарату сравнения.

Учитывая полученные в отношении штамма вируса гриппа  А/Гонконг/1/68 (H3N2)  результаты,  для определения  антивирусной активности нового  БАВ относительно   штамма  вируса  гриппа   А/PR/8/34  (H1N1) были выбраны концентрации 1750 и 184 мкг/мл. Приведённые  в табл. 2 результаты свидетельствуют  о том, что новое соединение в концентрациях 1750 и 184 мкг/ мл  в  значительной степени  подавляло   репродукцию вируса А/PR/8/34 (H1N1) — на 3,08 и 3,33 lg ТИД50, соответственно, по сравнению с контролем  (р<0,05),  однако  несколько уступая по эффективности Тамифлю (410 мкг/мл), который  полностью  подавлял репродукцию данного вируса — на 4,17 lg ТИД₅₀ (р<0,05).

В отношении штамма птичьего  гриппа  H5N3  установлено, что новое соединение в концентрациях 1750 и противовирусная активность  нового соединения и препарата  сравнения на  модели  клеточной культуры МDСК представлена  в табл. 4.368 мкг/мл  полностью  ингибировало его репродукцию на тканевой  культуре ХАО — на 4,25 и 4,08 lg ТИД₅₀ соответственно (р>0,05), превышая действие Тамифлю 410 мкг/мл) — 3,75 lg ТИД₅₀. (табл.3)

Поскольку   МПК   кобальт  бис(цитрато)станната на этой модели ниже (368 мкг/мл), противогриппозное действие вещества изучали именно в этой концентрации.

Результаты  исследований показали, что репродукция вируса гриппа  человека штаммов А/Гонконг/1/68 (H3N2)   подавлялась   изучаемым  соединением достоверно относительно контроля 2,2 lg ТИД₅₀, однако БАВ практически в 2 раза уступало по активности референс-препарату (4,33 lgТИД₅₀). В отношении штамма А/PR/8/34  (H1N1)   ингибирование  репродукции был несколько ниже при использовании и нового БАВ, и Тамифлю  (1,6 и 3,33 lg ТИД₅₀, соответственно). Но в обоих  случаях торможение репродукции было  статически достоверным  (р> 0,05 по К.З.)  по отношению к контролю.

Результаты

1. Кобальт  бис(цитрато)станнат в концентрации 7000 мкг/мл  полностью  подавлял репродукцию  штамма вируса гриппа  А/Гонконг/1/68 (H3N2). В концентрациях  1750  и  184 мкг/мл   в  значительной степени подавлял  репродукцию  вируса А/PR/8/34 (H1N1), а в концентрациях 1750 и 368 мкг/мл  полностью  подавлял репродукцию штамма вируса гриппа птиц H5N3 на тканевой  культуре ХАО.
2. Во всех трех вышеперечисленных сериях экспериментов новое соединение по противовирусной активности было  сопоставимо с препаратом   сравнения тамифлю,  статистичеки недостоверное несколько уступая или превышая его действие.
3. На тканевой  культуре МDCK  кобальт бис(цитрато)станнат   в  концентрации 368  мкг/мл   проявлял статистически значимое  относительно контроля  тормозящее  действие  на репродукцию  вируса гриппа  человека штаммов  А/Гонконг/1/68 (H3N2)  и А/PR/8/34 (H1N1),  однако   уступало  по  эффективности  референс-препарату.

Основные выводы

Новое биологически активное  вещество  — кобальт бис(цитрато)станнат оказывает  отчётливое  дозозависимое противовирусное действие в отношении вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (H3N2) и А/PR/8/34 (H1N1), а также вируса гриппа птиц H5N3 на обоих применяемых моделях.

Выявленная противовирусная активность   кобальт бис(цитрат)станната, наряду  с его низкой  токсичностью, раскрывает  перспективу  дальнейшего  доклинического исследования данного БАВ.

Таблица 1

Влияние кобальт бис(цитрато)станната на репродукцию штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканевой  культуре ХАО

Примечание:   * — достоверность различий по отношению к контролю (р<0,05)

# — достоверность различий по отношению к референс-препарату  (р<0,05)

Влияние кобальт бис(цитрат)станната на репродукцию штамма вируса гриппа А/PR/8/34 (H1N1) на тканевой  культуре ХАО

Таблица 2

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю (р<0,05)

Влияние кобальт бис(цитрат)станната на репродукцию штамма вируса птичьего гриппа H5N3 на тканевой  культуре ХАО

Таблица 3 

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю (р<0,05)

Влияние кобальт бис(цитрато)станната на репродукцию штаммов вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68  (H3N2) и А/PR/8/34 (H1N1) на тканевой  культуре МDCK

Таблица 4

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю (р<0,05)

# — достоверность различий по отношению к референс-препарату  (р<0,05)

Литература

1. Петров Р.В. Вакцинация против гриппа: проблемы и успехи. // Лечащий врач. — 2007. — №9. — С. 93–96.
2. Viboud , Bolle P.Y., Cauchemez S., at all. Risk factors of influenza transmission in households. // Br. J. Gen. Prac. — 2004. — № 54 (506). — P. 684-689.
3. Осидак Л.В. Дриневский В.П., Ерофеева М.К. Грипп как проблема XXI века. // Детские инфекции. — 2009. — Т. 8. №3. — С. 3—9.
4. Sturm-Ramirez  M.,  Ellis T.,  Bousfield B., et al. Re-emerging  H5N1  influenza  viruses in Hong  Kong in 2002 are higly pathogenic  to ducks.// J.Virol. — 2004. — №78. — P. 4892-4901.
5. Whitley R. , Hayden F.G., Reisinger K.S. Oral oseltamivir treatment in children. // Ped. Inf. Dis. — 2001. — N 2. — P. 127—133.
6. 6. Bright A., Shay D., Shu B., et al. Adamantane  resistance among influenza A voruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the Unated  States. // Jornal of the American Medical Association. — 2006. — vol.295 (doi:10.1001/jama.295.8.joc60020).
7. Добра Е.А. Противовирусные лекарственные средства в фармакотерапии гриппа и ОРВИ. // Провизор. — 2011. — № 2. — С. 33–36.
8. Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. — М.: «Гэотар-Медиа», 2007. 320 с.
9. Бурачева С.А., Прискарь И.И., Цапилов В.И. Синтез и противомикробная активность координационных соединений меди с тиосемикарбазонами замещенных салицилового альдегида. Бурачева. // Химико-фармацевтический журнал, 2005. — Т. 6. — №39. — С. 30–33.
10. Леглер Е.В., Казаченко A.C., Казбанов В.И. Синтез и антимикробная активность комплексных соединений серебра с аргинином и глутаминовой кислотой. // Хим-фарм.журнал. — 2001. — Т.35. — №9 — С.35–36.
11. Eds. M. Gielen, E. R. T. Tiekink. Metallotherapeutic Drugs and Metal-Based Diagnostic  Agents. The Use of Metals in Medi-cine. Weinheim: Wiley-VCH, 2005. 598 p
12. Зинченко А. И., Паруль Д.А. Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. — Мн.: Выш. шк., 2005. 214 с.
13. Марцинко Е.Э., Миначева Л.Х., Чебаненко Е.А., Сейфуллина И.И. и др. Условия  образования гетерометаллических комплексов в системах  GeCl4  (SnCl4)  — лимонная  кислота   — M(CH3COO)2  — H2O.  Кристаллическая  и  молекулярная  структура  [M(H2O)6] [Ge(НCit)2]?4H2O (M=  Mg, Mn,  Co, Cu, Zn) и [M(H2O)6][Sn(НCit)2]•4H2O (M=  Mg, Co, Ni) // Журн. неорган.  химии.  — 2013. — Т. 58, № 5. — С.588-595.
14. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. Рекомендации / под. ред. чл.кор. АМН Украины А.В. Стефанова — К. Авіцена. 2002. 567 с.
15. Пат. 15629 А Україна, МПК G01N  33/15,  C12Q 1/18. Спосіб оцінки  ступеня цитотоксичності біологічно  активних  сполук та фармакологічних  препаратів.  Лозицький В.П., Григорашева  І.М.,  Федчук А.С. [та ін.]; заявник-патентоутримувач Український наук.-досл. Протичумний ін.-т, ТОВ „Відродження М”. — №u2005 12542; заявл. 12.05; опубл. 17.07.06, Бюл. №7.
16. Ильенко В.И. Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа: методические рекомендации. Всесоюзный НИИ гриппа МЗ СССР.  — Ленинград,  1977. 36 с.
17.  Kaverin V., Webster R.G. Impairment of multicycle influenza  virus growth in Ver (WHO)  cells by loss of trypsin  activity. J Virol, 1995;69: 4: 2700—2703.
18. Ашмарин И.П. Вычисление ЕД при малом числе подопытных  животных. // Ж. микробиол. — 1959. — №2. — С.102–108.
19. Гублер Е.В.  Применение   непараметрических   критериев    статистики    в   медико-биологических   исследованиях   /  Е.В.Гублер, А.А.Генкин.  — Л.: Медицина, 1973. — 142с.